骨保護素/脫蛋白骨對兔前交叉韌帶重建腱-骨早期愈合的影響

管林聰，鄒國耀，唐志宏，宋恩鴻，魏　冰

骨保護素/脫蛋白骨對兔前交叉韌帶重建腱-骨早期愈合的影響

管林聰，鄒國耀，唐志宏，宋恩鴻，魏冰

目的 探討骨保護素（OPG）/脫蛋白骨（DPB）復合物對兔前交叉韌帶（ACL）重建腱-骨早期愈合的影響。方法制備OPG/DPB復合物。80只實驗兔隨機分為4組（n= 20），即OPG、DPB、OPG/DPB及對照組，均建立ACL重建模型。實驗組腱-骨界面分別相應植入OPG、DPB及OPG/ DPB，對照組不做處理。術后4、8、12周取材，行病理觀察及生物力學檢測。結果 術后各時間點，OPG/DPB組腱-骨界面成熟度、Sharpey纖維數量及移植肌腱抗拉性能優于其余3組。結論 OPG/DPB復合物可顯著促進ACL重建術后腱-骨早期愈合。

骨保護素；脫蛋白骨；復合物；前交叉韌帶；重建

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.030.html

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是穩定膝關節的重要結構，一旦損傷常造成膝關節松動進而影響功能。治療方法首選ACL重建，但部分患者術后腱-骨愈合不良影響手術效果。能否解決腱-骨愈合不良問題成為評判ACL重建是否成功的重要指標［1］。骨保護素（osteoprotegerin，OPG）有促進骨愈合作用，可應用于ACL重建術提高手術效果，但由于“滑液灌注效應”等的影響，腱-骨界面中單純應用OPG易流失。脫蛋白骨（deproteinized bone，DPB）為目前研究成熟的具有緩釋功能的載體材料，該實驗將OPG復合于DPB后植入ACL重建動物模型中，觀察其對腱-骨早期愈合的影響，旨在為臨床提供促進腱-骨愈合理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1OPG/DPB復合物制作 根據丁真奇等［2］方法制備DPB，經洗滌、搗碎、環氧乙烷消毒備用。將DPB與OPG（北京博奧森生物技術有限公司，編號：EA-1016，0.5 mg，凍干粉劑）水溶液混合后真空條件下置于4℃低溫4～6 h，使OPG水溶液充分吸附于DPB，即制作成OPG/DPB復合物，置于4℃冰箱常壓保存備用。

1.1.2動物分組 80只清潔級健康成年新西蘭大白兔（月齡6～8個月），雌雄不限，2.5～3.5 kg（由桂林醫學院動物實驗中心提供），隨機分為4組（n =20）：OPG、DPB、OPG/DPB及對照組。實驗動物術前飲食、活動正常，雙膝抽屜試驗及Lachman試驗均陰性。選左側膝關節行ACL重建。

1.2手術方法及術后處理 實驗動物術前禁飲食6 h，10%水合氯醛（3 ml/kg體重）耳緣靜脈全麻。參照本課題組鄒國耀等［3］前期研究方法行ACL重建。根據史沖等［4］研究結論：骨隧道內移植肌腱長度在15～20 mm范圍時其抗拉力程度可達到最大效果。本實驗造模時確保各組移植肌腱在骨隧道內長度均≥17 mm。直徑為1.5 mm克氏針建立骨隧道后用直徑為2 mm絲攻器絲攻處理，使骨隧道內壁螺紋化，生理鹽水沖洗骨碎片。OPG組每只動物100 μg OPG，溶于水后分別于脛骨及股骨隧道內注射，使其充分滲入松質骨內，移植肌腱固定后繼續于骨隧道內外口腱-骨界面周圍注射。DPB組每只動物1 g DPB，用克氏針鈍頭將DPB推送入骨隧道內，向隧道內壁各方向涂抹，使DPB充分散布于螺紋間隙內，移植肌腱固定后繼續于骨隧道內外口腱-骨界面周圍填入DPB。OPG/DPB組每只動物同法植入100 μg OPG+1 g DPB復合物，對照組除ACL重建外不做任何處理。沖洗關節腔及手術切口，逐層縫合，術后分籠飼養自由活動，連續3 d行20萬單位青霉素肌注預防感染，擇期換藥、拆線。

1.3觀測指標

1.3.1一般情況及大體觀察 術后觀察動物飲食、關節活動及術口愈合情況，不同時點獲取完整膝關節標本，行大體觀察。

1.3.2生物力學檢測 術后4、8、12周各組隨機處死6只實驗動物，于膝關節上下3 cm截取完整膝關節標本，緊貼骨隧道外口離斷移植肌腱及編織縫線，離斷膝關節間隙除移植肌腱外所有軟組織，將脛骨及股骨分別固定于CMT 4104微機控制電子萬能試驗機（深圳市世紀天源儀器有限公司）牽拉臺兩端，以5.0 mm/s的速度進行牽拉試驗直至移植肌腱撥出或斷裂，并記錄肌腱撥出或斷裂瞬間的最大加載負荷。

1.3.3組織學觀察 剔除標本表面所有軟組織及骨膜，經體積濃度為10%甲醛水溶液固定48 h，脫鈣72 h后（體積濃度45%的鹽酸45 ml、體積濃度55%的甲酸55 ml加蒸餾水450 ml構成脫鈣液），常規沖水、脫水、浸漬、包埋、切片，HE染色，光鏡觀察腱-骨界面組織形態。

1.4統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，數據均以±s表示。計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。

2　結果

2.1一般情況觀察 術后1～3 d實驗動物精神欠佳，飲食、活動少，后逐漸恢復正常。術后6 d有3只動物出現自咬切口現象，導致切口感染，經清創縫合、抗生素預防感染、換藥后愈合良好，術后9 d有1只動物因拒飲食死亡。

2.2大體觀察 術后4周時，各組骨隧道內口由瘢痕組織填充；8周時，OPG、OPG/DPB組骨隧道內口由軟骨組織填充，DPB、對照組骨化不明顯；12周時，OPG、OPG/DPB組由骨樣組織完全封閉，DPB、對照組骨化不如OPG、OPG/DPB組且各有2例標本出現明顯骨隧道擴大。見圖1。

圖1　大體觀察A：骨隧道內口為瘢痕組織封閉；B：部分標本出現明顯骨隧道擴大；C：骨隧道內口為軟骨組織封閉；D：骨隧道內口為骨樣組織封閉

2.3生物力學檢測 術后4周，各組最大加載負荷組間比較差異無統計學意義；8周時，OPG/DPB組最大加載負荷高于OPG組，OPG組最大加載負荷高于DPB、對照組，OPG組與OPG/DPB組比較、OPG組與DPB組比較差異有統計學意義（P＜0.05），DPB組與對照組比較差異無統計學意義；術后12周，各組間比較差異無統計學意義。見表1。

2.4組織學觀察

2.4.1低倍鏡觀察 術后4周，OPG組腱-骨界面組織排列疏松，有散在新生骨細胞；DPB組腱-骨結合欠緊密，有少許新生骨細胞；OPG/DPB組腱-骨界面膠原纖維排列緊密，新生骨細胞較OPG組多且成熟；對照組腱-骨界面組織疏松，成骨不明顯。見圖2。術后8周，OPG組可見與腱-骨界面成一定角度的Sharpey樣纖維，部分纖維長入肌腱，組織排列較緊密。DPB組有少許Sharpey樣纖維，但較OPG組少，腱-骨結合紋理紊亂。OPG/DPB組可見排列密集的垂直腱-骨界面的Sharpey樣纖維，纖維及新生骨長入肌腱，腱-骨連接較OPG組緊密；對照組偶見Sharpey樣纖維，新生骨細胞趨向肌腱生長，腱-骨結合疏松。見圖3。術后12周，OPG組腱-骨界面成骨明顯，形成不典型的直接愈合結構。DPB組膠原纖維及新生骨細胞長入肌腱，形成連續性纖維軟骨連接。OPG/DPB組腱-骨界面幾乎全部由新生骨填充，新生骨細胞鈣化成熟，Sharpey樣纖維較8周時減少，形成帶模糊“潮線”結構的腱-骨移行改變帶，但仍不如正常ACL止點。對照組腱-骨界面逐漸成熟，但纖維骨組織分化較OPG組差，腱-骨過渡組織狹窄。見圖4。

表1　各組不同時點生物力學檢測結果比較（n=6，±s）

表1　各組不同時點生物力學檢測結果比較（n=6，±s）

與OPG組比較：*P＜0.05

時間OPG組DPB組OPG/DPB組對照組F值P值81.490.25 8周71.33±9.7758.00±12.65*83.83±4.75*55.17±11.44*10.230.00 12周83.50±2.6680.17±8.0684.67±2.1681.17±8.1 4周35.00±2.5331.83±3.6634.67±2.8833.17±2.4 30.720.55

圖2　術后4周組織學觀察 HE×100A：OPG組；B：DPB組；C：OPG/DPB組；D：對照組

圖3　術后8周組織學觀察 HE×100A：OPG組；B：DPB組；C：OPG/DPB組；D：對照組

2.4.2高倍鏡觀察 術后4周，各組腱-骨界面高倍鏡下觀察皆為纖維結締組織；8周時可見數量不等的Sharpey樣纖維，OPG/DPB組多于OPG組，OPG組多于DPB組、對照組，OPG組與OPG/DPB組比較、OPG組與DPB組比較差異有統計學意義（P＜0.05），DPB組與對照組比較差異無統計學意義；12周時Sharpey樣纖維減少，取而代之為連續性纖維軟骨連接及帶“潮線”的近似直接止點結構，各組間比較差異無統計學意義。見表2、圖5。

3　討論

腱-骨是否愈合良好影響ACL重建效果。研究［5-6］表明腱-骨愈合可分為間接愈合和直接愈合，間接愈合即移植肌腱通過Sharpey樣纖維與骨隧道壁連接形成間接止點；直接愈合即移植肌腱通過礦化的膠原纖維與骨隧道壁連接形成直接止點，且形成嗜堿性染色的“潮線”結構。如何促進ACL重建術后腱-骨早期、可靠的愈合成為當前研究熱點［7］。王永健等［8］用自體腘繩肌腱移植重建兔ACL，認為腱-骨界面的愈合轉歸為移植肌腱與骨隧道壁之間形成纖維連接、纖維骨化、骨組織長入肌腱進而再塑形的過程，最終形成典型的直接止點結構，即由間接愈合向直接愈合過渡。本研究顯示術后4周，各組腱-骨界面由紊亂的纖維結締組織填充。8周時均形成Sharpey樣纖維連接，以OPG/ DPB組最明顯。至12周時，OPG/DPB組腱-骨界面均較其余組成熟，且形成帶有“潮線”結構的類似直接止點的腱-骨移行改變帶。表明OPG/DPB復合物可顯著促進ACL重建術后腱-骨界面直接止點的形成。

表2　各組不同時間點Sharpey纖維數量統計（n=6，±s）

表2　各組不同時間點Sharpey纖維數量統計（n=6，±s）

與OPG組比較：*P＜0.05

時間OPG組DPB組OPG/DPB組對照組F值P值--8周16.67±1.379.67±1.63*20.33±2.50*11.67±1.21*45.710.00 12周7.33±2.166.67±1.758.17±2.146.00±1.411.4 4周0000 40.26

圖4 術后12周組織學觀察 HE×100A：OPG組；B：DPB組；C：OPG/DPB組；D：對照組

圖5　高倍鏡下組織學觀察HE×400A：術后4周；B：術后8周；C：術后12周

ACL重建使移植肌腱發揮原有韌帶功能，恢復膝關節的穩定性，但只有移植肌腱與骨隧道壁形成牢固的愈合才能達到有效的力學強度［9-10］。研究［11］表明常規ACL重建后腱-骨界面形成正常止點需24周甚至更長，這意味著術后早期行功能鍛煉時移植肌腱所承受的應力負荷與腱-骨間接愈合相關，因此Sharpey樣纖維數量決定移植肌腱抗拉程度。本研究顯示：術后4周各組未見Sharpey樣纖維，生物力學檢測組間比較差異無統計學意義。8周時，各組可見數量不等的Sharpey樣纖維連接，以OPG/DPB組最多，生物力學檢測示OPG/DPB組最大加載負荷均高于其余組，且差異有統計學意義。至12周時，Sharpey樣纖維數量較8周時減少，腱-骨界面趨向直接止點成熟，各組生物力學檢測組間比較差異無統計學意義。表明OPG/DPB復合物可顯著提高ACL重建術后早期移植肌腱抗拉性能。

OPG可特異性抑制破骨細胞進而促進成骨，安明等［12］實驗觀察OPG對兔ACL重建術后腱-骨愈合的影響，證實OPG能有效促進腱-骨早期愈合。但OPG為可溶性糖蛋白，由于“滑液灌注效應”等的影響，骨隧道中單純應用OPG易流失。Gulotta et al［13］將粘合劑填入腱-骨界面內，結果顯示實驗組腱-骨愈合更牢固，說明減少“滑液灌注效應”可有效促進腱-骨愈合。DPB為目前研究成熟的載體，有骨傳導活性又不引起排斥反應，其疏松的多孔隙網狀結構是理想的骨組織工程支架材料。翟文亮等［14］將富血小板血漿復合于DPB后植入ACL重建動物模型中，結果證實PRP/DPB復合物可顯著促進腱-骨愈合。本實驗植入OPG/DPB復合物使腱-骨結合更緊密，有利于減少“鐘擺效應”預防骨隧道擴大，從而減少“滑液灌注效應”所致的OPG流失，其緩慢釋放的OPG有利于長效誘導骨組織再生。本研究顯示術后各時間點，OPG/DPB組腱-骨界面成熟度、Sharpey纖維數量及移植肌腱抗拉性能均優于其余組，說明提高骨組織長入肌腱可有效促進腱-骨愈合。

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Effect of osteoprotegerin combined with deproteinized bone on early tendon-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction in rabbits

Guan Lincong，Zou Guoyao，Tang Zhihong，et al
（Dept of Spinal and Osteopathy Surgery，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001）

Objective To discuss the effect of osteoprotegerin（OPG）combined with deproteinized bone（DPB）on early tendon-bone healing after anterior cruciate ligament（ACL）reconstruction in rabbits.Methods The complex of OPG/DPB was prepared.80 experimental rabbits were randomly divided into 4 groups（n=20）：OPG，DPB，OPG/DPB and control，ACL was reconstructed.The bone tunnels were filled with substances correspondingly except control group.The specimens were obtained for biomechanics test 4，8 and 12 weeks after surgery，then used it for pathological observation.Results At different time points after surgery，group OPG/DPB was superior to rest of the three groups in tendon-bone interfaced maturity，quantity of Sharpey fiber and tensile properties of transplanted tendons.Conclusion The complex of OPG/DPB can promote early tendon-bone healing after ACL reconstruction.

osteoprotegerin；deproteinized bone；complex；anterior cruciate ligament；reconstruction

R 686.5

A

1000-1492（2016）06-0827-05

2016-01-18接收

廣西自然科學基金項目（編號：2014GXNSFAA118239）

桂林醫學院附屬醫院脊柱骨病外科，桂林 541001

管林聰，男，碩士研究生；鄒國耀，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhouguoyao2000@aliyun.com