腦膠質瘤癌組織與血清CDO-1基因啟動子甲基化狀態研究

楊成子，徐培坤，王　斌，鄧鵬程，洪　洋，李顯雄，李式浩

腦膠質瘤癌組織與血清CDO-1基因啟動子甲基化狀態研究

楊成子1，徐培坤1，王斌2，鄧鵬程2，洪洋3，李顯雄3，李式浩3

目的 探討腦膠質瘤腫瘤組織及血清中半胱氨酸雙加氧酶-1（CDO-1）基因啟動子區域甲基化程度與腫瘤相關性及臨床意義。方法 實驗組取50例病理證實為腦膠質瘤患者的腫瘤組織及血清標本，另取20例腦外傷患者壞死腦組織、血清及20例健康者血清標本為對照組。應用甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）和亞硫酸氫鹽測序（BSP）檢測CDO-1基因甲基化水平。結果 實驗組腫瘤組織中CDO-1基因啟動子區域甲基化率為44.0%（22/50），血清中甲基化率為36.0%（18/50），而對照組中均未發現明顯甲基化。腦膠質瘤患者的腫瘤組織DNA中，女性患者CDO-1基因啟動子區域甲基化發生率為64.0%（16/25），明顯高于男性患者的24.0%（6/25），兩者差異有統計學意義（P=0.004）。血清DNA中，女性患者CDO-1基因啟動子區域甲基化的發生率為52.0%（13/25），同樣明顯高于男性患者的20.0%（5/ 25），兩者差異有統計學意義（P=0.012）。另外，腫瘤組織的CDO-1基因啟動子區域甲基化水平在不同年齡、病理類型和病理分級之間的差異無統計學意義。結論 腦膠質瘤患者腫瘤組織和血清DNA中存在CDO-1基因啟動子區域的異常甲基化狀態，并且女性患者甲基化水平明顯高于男性患者。血清DNA CDO-1啟動子區域的異常甲基化檢測有可能成為一種非侵入性的診斷腦膠質瘤的生物學標記物。

半胱氨酸雙加氧酶；基因；啟動子；甲基化；腦膠質瘤

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：11 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.038.html

半胱氨酸雙加氧酶（cysteine dioxygenase，CDO）是一種金屬蛋白酶，參與半胱氨酸水平的調節和?；撬岷铣?。CDO-1分布于細胞質中，由位于5q23.2的CDO-1基因表達，CDO-2以膜結合蛋白形式存在。CDO基因哺乳動物中高度保守，跨度約15 000 bp，包含5個外顯子［1］。該區域在進展期肺癌患者中經常出現缺失［2］，并在結腸直腸癌患者中出現異常表達［3］。人類乳腺癌患者中，CDO-1基因存在異常甲基化，且與疾病進展及預后密切相關［4］，并在小鼠的乳腺原位導管癌模型中證實乳腺上皮內瘤的惡性轉化與CDO-1的表達抑制有關［5］。腎透明細胞癌和食管鱗癌患者的CDO-1基因甲基化程度也提示預后，且獨立于其他因素［6-7］，實驗［8-9］證實逆甲基化可以部分程度抑制腫瘤細胞生長。研究［1，5］顯示，多種腫瘤組織及其對應細胞系中的CDO-1 mRNA和蛋白水平表達下調；而體外培養及小鼠模型體內人類腫瘤細胞的生長可以被CDO-1的高表達所抑制。因此通過甲基化調控CDO-1基因表達可能參與多種腫瘤的發生發展。然而，目前關于腦膠質瘤患者體內CDO-1基因甲基化程度尚不明確，該實驗通過研究腦膠質瘤患者腫瘤組織、血清DNA中CDO-1基因異常甲基化，探索其與腦膠質瘤發生發展的關聯，及血清DNA CDO-1基因甲基化做為腦膠質瘤血清學標記物的可能。

1　材料與方法

1.1材料 實驗組臨床標本取自2014年2月～2014年12月在安徽醫科大學第一附屬醫院神經外科首次手術治療的50例膠質瘤患者的腫瘤組織及對應血清標本。所有標本經我院病理科確診為膠質瘤，患者術前未行放、化療等其他治療，可排除前期治療對實驗結果的干擾。對照組取自20例顱腦外傷患者術中棄去的壞死腦組織及對應血清標本和20例健康者血清標本。實驗組及對照組組織標本離體后立即置于液氮內保存備用，血標本則在患者空腹12 h后于次日晨間抽取，注入含有促凝劑的負壓采血管中，離心機中3 000 r/min離心5 min，吸取上層血清，封裝于2 ml EP管中，立即置于液氮內保存。實驗中因涉及人體組織，均與患者和（或）監護人溝通，并簽署知情同意書，并經倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1DNA樣本提取和亞硫酸氫鈉修飾 取腫瘤標本中心部位組織10 mg，加入適量液氮快速充分研磨至勻漿；為保證樣本量足夠取樣血清樣本400 μl；使用Axygen基因組DNA試劑盒（貨號：AP-MN-BL-GDNA-50），根據使用說明書提取DNA并用分光光度計檢測所提取DNA的濃度和純度；DNA樣本制備后取樣，以體積20 μl，總量200～500 ng為宜；亞硫酸氫鹽修飾采用MethylCDO-1eTMBisulfite conversion Kit試劑盒（美國Invitrogen公司，貨號：MECOV-50），根據使用說明完成修飾。

1.2.2修飾后DNA樣本PCR擴增 CDO-1基因的引物分為甲基化引物和非甲基化兩組，甲基化上游引物：5′-TTCGGCGTAGGTTGTTCGTA-3′，下游引物：5′-CGCGAAAACGCAACCAAC-3′；非甲基化上游引物：5′-GTTTTGGTGTAGGTTGTTTGTATTG-3′，下游引物：5′-CAACAATCCCACCCCAATC-3′。引物由上海Invitrogen公司設計。PCR反應體系：包括10× PCR緩沖液2.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、Platinum?Taq DNA聚合酶0.2 μl、上下游引物各1 μl、50 mmol/L MgCl20.8 μl、DNA模板1 μl、ddH2O 18 μl；共計25 μl。PCR擴增循環參數：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s、72℃延伸30 s，三步驟循環35個周期，最后于72℃下行終末延伸5 min后完成擴增。PCR擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得電泳圖見圖1。

圖1　CDO-1基因甲基化檢測電泳圖M：DNA Marker；A：血清DNA；B：腫瘤組織；M為使用甲基化，U為非甲基化

1.2.3PCR擴增產物的TA測序 樣本提取及亞硫酸氫鈉修飾步驟同前。PCR引物設計同為上海Invitrogen公司設計合成，CDO-1基因上游引物：5′-TGTGTYGATGTTTGTTTATGTT-3′，下游引物：5′-AAATTCCRCATAACRAAACT-3′。PCR步驟同前。電泳后用Axygen凝膠回收試劑盒對PCR產物進行回收純化。于0.2 ml離心管內制備反應溶液：PCR回收產物2 μl、pMD18-T Vector 0.5 μl、SolutionⅠ2.5 μl，共計5 μl?；旌暇鶆蚝笥?6℃水浴連接30 min以上。轉化：冰上溶解凍存的DH5α（200 μl/ tube）感受態細胞，加入連接產物5 μl，輕柔混勻后冰浴30 min，42℃熱激90 s后立即冰浴2 min。于無抗性LB培養基中加入500 μl菌液，37℃下搖床（200 r/min）中培養45 min制備預轉化菌液。于超凈臺中取200 μl預轉化菌液涂布至含100 μg/ml氨芐的平板上，恒溫培養箱中37℃倒置培養過夜。測序：克隆完成后，挑取多個克隆進行測序（測序工作由上海Invitrogen生物技術公司完成）。

1.3統計學處理 應用SPSS 13.0軟件進行分析，不同性別、年齡段、腫瘤級別之間CDO-1基因啟動子區甲基化狀態差異采用Χ2檢驗，比較不同病理類型之間甲基化狀態差異采用Fisher精確檢驗。

2　結果

2.1臨床資料統計及分析 實驗組中男25例，女25例；年齡19～77歲，中位年齡41.5歲。對照組中男20例，女20例；年齡20～67歲，中位年齡42歲。實驗組中腫瘤組織按《WHO中樞神經系統腫瘤分類（2007）》病理分級，低級別（Ⅰ～Ⅱ）組26例，高級別（Ⅲ～Ⅳ）組24例。其中，星形細胞瘤15例、少枝膠質細胞瘤10例、膠質母細胞瘤15例、髓母細胞瘤7例、室管膜瘤3例。

2.2實驗組與對照組結果對比分析 組織及血清DNA經亞硫酸氫鹽修飾后，未發生甲基化的DNA序列中胞嘧啶會轉化胸腺嘧啶，而發生甲基化的DNA序列中胞嘧啶則保持不變，因此，根據測序結果可以判讀目的產物中是否存在甲基化現象。實驗組中44.0%（22/50）的腫瘤標本和36.0%（18/50）的血清標本中檢測到不同程度的CDO-1基因啟動子區域甲基化，而對照組中均未能檢測出甲基化。見圖1、2。

2.3實驗組內部差異對比分析 腦膠質瘤患者的腫瘤組織DNA中，女性患者CDO-1基因啟動子區域甲基化發生率為64.0%（16/25），明顯高于男性患者的24.0%（6/25），兩者差異有統計學意義（P =0.004）。血清DNA中，女性患者CDO-1基因啟動子區域甲基化的發生率為50.0%（13/25），同樣明顯高于男性患者的20.0%（5/25），兩者差異有統計學意義（P=0.012）。而在與年齡、病理類型和病理分級之間的相關性經統計學分析，其差異無統計學意義。見表1。

表1　CDO-1基因啟動子甲基化與臨床病理特征關系

圖2　PCR產物測序圖A、B：實驗組腫瘤組織及血清DNA PCR產物測序，有甲基化（胞嘧啶未發生改變）；C：對照組PCR產物，無甲基化（胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶）

3　討論

CDO-1基因作為一種新的抑癌基因，已有研究［9-11］證實了這一基因啟動子區域甲基化與乳腺癌、食管鱗癌、結腸直腸癌和腎透明細胞癌等腫瘤的預后存在關聯。MGMT、SLC22A18、PDGF-B、ppENK、EDNRB、p16等多種基因的甲基化均與膠質瘤的發生發展有關［10-11］，研究［12］顯示，半胱氨酸代謝途徑在侵襲性膠質細胞瘤的發病機制中發揮著重要作用。CDO是半胱氨酸分解代謝過程的關鍵酶，CDO-2為膜結合蛋白，CDO-1分布于胞質中，CDO-1基因啟動子區域異常甲基化引起表達減少，從而影響半胱氨酸代謝。因而考慮CDO-1基因啟動子區域甲基化可能與腦膠質瘤有關。本研究顯示，實驗組腦腫瘤組織中CDO-1基因啟動子區域甲基化發生率為44.0%（22/50），而對照組標本中均未出現相關甲基化現象，因此推斷CDO-1基因啟動子區域甲基化可能是腦膠質瘤的發生發展中一個重要事件。

Brait et al［1］發現乳腺癌患者中，CDO-1基因表達下調表現出明顯的性別差異。研究［13］顯示小鼠體內半胱氨酸代謝具有性別差異，雌鼠體內CDO酶含量明顯高于雄鼠，并在敲除CDO基因后，雌鼠出生后死亡率也明顯高于雄鼠。同樣的情況在原發性肝癌的研究［14-15］中也獲得證實。本研究也證實腦膠質瘤患者中CDO-1基因甲基化也存在性別差異。

Yamashita et al［3］研究中，不僅證實CDO-1啟動子區域的甲基化與結腸直腸癌的預后相關，血清DNA中相關基因甲基化的檢測也被證實具有臨床診斷價值。在原發性肝癌的研究［13］中也得出類似結論。由于腦膠質瘤目前尚無相對特異性的腫瘤標志物，血清DNA基因甲基化的研究更具有價值。研究［10］已經證實包括Alu、p16等基因在血清DNA中的甲基化與腦膠質瘤的相關性，并取得一定進展。本研究顯示，血清DNA中CDO-1基因啟動子區域的甲基化率為36.0%（18/50），而對照組血清DNA中未檢測出相關區域甲基化，差異有統計學意義。據此推測，CDO-1基因啟動子區域甲基化與腦膠質瘤存在一定關聯，并具有通過血清DNA檢測的可能性。

綜上所述，該研究檢測出腦膠質瘤患者腫瘤組織和血清DNA中存在CDO-1基因啟動子區域的異常甲基化狀態，結果顯示其遠高于正常人群，且女性患者明顯高于男性患者，為研究腦膠質瘤的發病機制和通過血清DNA檢測診斷腦膠質瘤提供了新的思路。

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Methylated CDO-1 gene promoter in the serum and tumor tissue of patients with glioma

Yang Chengzi1，Xu Peikun1，Wang Bin2，et al
（1Dept of Pathophysiology，2Dept of Microbiology and Parasitology，Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To explore the frequency of CDO-1 gene promoter mehtylation in serum and tumor tissue of patients with human brain glioma.Methods Serum and tumor tissues of 50 patients suffered glioma were selected as the experimental group.Necrotic brain tissue and serum of 20 patients with traumatic brain injury and serum of 10 healthy people were selected as the control group.By using nest PCR and bisulifte PCR，we investigated methylation status of CDO-1 gene promoter in serum and tumor or necrotic brain tissue of both groups and their association with patient clinical history.Results The study found the frequency of CDO-1 gene promoter mehtylation among 44.0%of total tumor samples（22/50），with 64.0%（16/25）among female patients while 24.0%（6/25）among male patients，which was statistically significant，while similar results found in serum，52.0%（13/25）in female to 20%（5/25）in male and 36.0%（18/50）totally.However，methylation was not found in the control group. The present study had failed to find correlation between the frequency of CDO-1 gene promoter mehtylation andclinical data except gender gap.Conclusion Mehtylated CDO-1 gene promoter was found in tumor samples and serum of patients with human brain glioma，and it may play an important role in the progress of human brain glioma.The present study has failed to find correlation between the frequency of CDO-1 gene promoter mehtylation and clinical data except gender gap.

cysteine dioxygenase-1；gene promoter；methylation；glioma

R 739.41

A

1000-1492（2016）06-0846-05

2016-04-06接收

安徽省科技攻關計劃項目（編號：1301042208）

安徽醫科大學第一附屬醫院1神經外科、2中心實驗室，合肥 230022

楊成子，男，碩士研究生；徐培坤，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xpk5909@163.com