血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7對特發性肺纖維化的診斷意義及與肺功能的關系

魯　未，趙　卉，魏　紅

血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7對特發性肺纖維化的診斷意義及與肺功能的關系

魯未1，趙卉1，魏紅2

目的 探討血清Ⅱ型肺泡細胞表面抗原（KL-6）、肺表面活性蛋白A（SP-A）、肺表面活性蛋白D（SP-D）及基質金屬蛋白酶7（MMP-7）對特發性肺纖維化（IPF）的診斷意義及與肺功能的關系。方法 收集38例IPF患者血清、38例肺炎患者血清及38例正常者血清標本，使用ELISA法檢測KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的水平，對血清標記物水平按受試者工作特性曲線（ROC）進一步分析，從中得出每種血清標記物的理想水平，并對IPF患者隨訪6個月，探索其對IPF的診斷意義及與肺功能的關系。結果 在IPF患者血清中KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的表達較肺炎對照組和健康對照組高，差異有統計學意義（P＜0.05）。KL-6的最佳截斷值為723.0 U/ml，SP-A為67.2 ng/ml，SP-D為98.1 ng/ml，MMP-7為10.1 ng/ml。KL-6診斷的敏感性、特異性為71.1%、98.7%；SP-A為81.6%、97.4%；SP-D為81.6%、97.4%；MMP-7為68.4%、98.7%。聯合KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7四種血清標志物的敏感性為100%，與單一血清指標比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。IPF患者血清SPA、MMP-7與用力肺活量在6個月內的變化有明顯的相關性（r1=-0.574、P1＜0.001，r2=-0.465、P2=0.003）。結論KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7在IPF患者的血清中高表達，在IPF患者的診斷中，四種血清標志物聯合檢測可提高IPF患者早期診斷的敏感性。聯合血清中SP-A、MMP-7水平可提高對IPF患者肺功能改變判斷的準確性，對疾病進展的預測有一定意義。

特發性肺纖維化；KL-6；SP-A；SP-D；MMP-7；ELISA

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：11 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.048.html

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）為一種特殊類型的慢性進展性纖維化型間質性肺炎，病因未明，好發于老年人，病變局限于肺，組織病理學表現為普通型間質性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）［1-2］，主要表現為成纖維細胞灶的形成、肺泡單位結構紊亂和肺纖維化。臨床表現為進行性呼吸困難，伴有刺激性干咳，雙肺聞及Velcro音，常有杵狀指，肺功能主要表現為限制性通氣障礙。IPF的患病率和病死率逐年增加，據估計在（4.6～16.3）/10萬，患病率大概在（13～20）/10萬［3］，中位生存時間為2～3年，缺乏有效治療藥物。而早期診斷和治療干預對于改善IPF患者預后具有重要意義［4］。IPF發病隱襲，機制不明，預后差。目前已有報道［5-8］Ⅱ型肺泡細胞表面抗原（krebs Yon den lungen-6，KL-6）、肺表面活性蛋白A（surfactant protein A，SP-A）、肺表面活性蛋白D（surfactant protein D，SP-D）及基質金屬蛋白酶7（matrix metalloprotease 7，MMP-7）對IPF的診斷、判斷疾病的進展有一定的價值。然而，既往報道對每種標記物的研究是獨立進行的，該研究為了進一步了解血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7在診斷中的作用，采用ELISA法聯合檢測血清中四種標記物的表達并進行對比分析，探討其在IPF診斷及疾病進展中的應用價值。

1　材料與方法

1.1病例資料 收集2014年6月～2015年5月安徽醫科大學第二附屬醫院及合肥電子工程學院門診部38例診斷為IPF的患者為IPF組。IPF的診斷標準［1］：①排除其他間質性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）（例如家庭或職業環境暴露相關ILD，結締組織疾病相關ILD和藥物毒性相關ILD）；②高分辨率CT（HRCT）表現為普通型間質性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）者，不建議行外科肺活檢；③不典型者（可能、疑似診斷者）需接受肺活檢：HRCT表現和肺活檢組織病理學表現符合特定的組合。排除標準［1］：其他肺間質纖維化疾病（過敏性肺炎、放射線肺炎、結節病）、結核病、惡性腫瘤的患者。所有患者臨床資料完整，明確診斷為IPF的38例患者中，男23例，女15例；年齡51～78（60.6±8.7）歲，另選同期入院的38例診斷為細菌性肺炎的患者為肺炎對照組，男22例，女16例；年齡47～81（60.3±9.3）歲，排除合并其他呼吸系統疾病（慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、肺癌等）及嚴重疾病（肝腎功能異常、結締組織疾病等）。同時選擇同期本院體檢中心健康成人38例作為正常對照組，男27例，女11例；年齡50～75（61.1±8.9）歲，兩組對照組匹配入組，均無間質性肺疾病病史及家族史。實驗組及對照組患者在年齡、性別等方面差異無統計學意義，具有可比性。

1.2主要試劑 KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7 ELISA檢測試劑盒（ELISA法）購自武漢華美公司。

1.3標本采集 實驗組和對照組采3～5 ml靜脈血結束后，室溫、3 500 r/min離心15 min，留取上清液1 ml分裝后放入-80℃冰箱保存。同時實驗組隨訪6個月，監測肺功能的變化。

1.4KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7血清指標含量檢測 采用人KL-6、人SP-A、人SP-D及人MMP-7 ELISA試劑盒檢測IPF組及對照組KL-6、SP-A、SPD及MMP-7血清指標含量：每孔各加入標準品或10、50、100倍稀釋IPF組樣本或對照組樣本100 μl，37℃孵育2 h，吸棄每孔液體，加入檢測溶液A 100 μl，37℃孵育1 h，洗板3次；加檢測溶液B 100 μl，37℃孵育30 min，洗板5次；加TMB底物90 μl，37℃避光反應15～20 min，每孔加入終止液100 μl，立即用酶標儀測定450 nm處光密度（optical density，OD）值。IPF組設置副孔，結果取兩孔平均值。繪制標準曲線，根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應檢測指標含量，再乘上稀釋倍數，即樣本的實際濃度。

1.5統計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料數據均以±s表示；樣本間均數比較采用t檢驗或方差分析，單因素相關分析采用Pearson相關分析。

2　結果

2.1ELISA法檢測血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的表達結果 在IPF患者血清中KL-6、SPA、SP-D及MMP-7的表達較肺炎對照組和健康對照組高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。肺炎對照組SP-A、SP-D較正常對照組高（P＜0.05），而KL-6、MMP-7在兩組之間差異無統計學意義（表1）。結果表明四種血清標記物與IPF之間具有良好相關性，聯合檢測對IPF的鑒別具有意義。

2.2血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7截斷值的意義 利用受試者工作特性曲線（ROC）曲線，KL-6的最佳截斷值為723.0 U/ml，SP-A為67.2 ng/ml，SP-D為98.1 ng/ml，MMP-7為10.1 ng/ml（圖1），其曲線下面積及95%置信區間見表2。KL-6診斷的敏感性、特異性為71.1%、98.7%；SP-A為81.6%、97.4%；SP-D為81.6%、97.4%；MMP-7為68.4%、98.7%。在IPF患者中血清SP-A及SP-D的敏感性最高，與血清KL-6及MMP-7比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。聯合任意兩種或三種血清標志物的敏感性均高于單一血清標志物（除外KL-6聯合MMP-7），但低于聯合四種血清標志物的敏感性。聯合KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7血清標志物的敏感性為100%，與單一血清指標比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1　血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的表達結果（±s）

表1　血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的表達結果（±s）

與IPF組比較：**P＜0.01；與肺炎對照組比較：#P＜0.05

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表2　血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的ROC曲線下面積及其95%置信區間

2.3IPF患者血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7與肺功能的關系 IPF患者入院后監測肺功能的變化，進一步分析四種血清標志物與肺功能的相關性結果顯示：KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7與用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、CO彌散量（diffusion capacity for carbon monoxide of the lung，DLCO）、肺總量（total lung capacit，TLC）等肺功能無明顯相關性。在IPF患者中SP-A、MMP-7與FVC在6個月內的變化有明顯的相關性（r1=-0.574、P1＜0.001；r2=-0.465、P2=0.003）。而KL-6、SP-D與FVC在6個月內的變化無明顯的相關性（r1=-0.297、P1= 0.070；r2=-0.078、P2=0.640）。見圖2。

表3　血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的敏感性比較

圖1　血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的ROC曲線A：KL-6；B：SP-A；C：SP-D；D：MMP-7

圖2　SP-A、MMP-7與FVC在6個月的變化值相關性A：SP-A；B：MMP-7

2.4SP-A、MMP-7與FVC變化量的關系 IPF患者血清中SP-A與MMP-7水平的高低與FVC在6個月內減少的程度呈顯著的相關性，血清SP-A與MMP-7的組合預測疾病進展比任單一生物標志物更好：在IPF患者中高水平的血清SP-A與MMP-7（SP-A≥67.2 ng/ml，MMP-7≥10.1 ng/ml）提示患者有較高頻率（28.5%）的肺功能下降（在6個月內FVC減少10%以上）。而血清SP-A與MMP-7水平均處于低水平的的患者，其肺功能下降的頻率為4.6%（表4、5）。

表4　IPF患血清SP-A和MMP-7與FVC變化量的關系：單一的生物標志物

表5　IPF患血清SP-A和MMP-7與FVC變化量的關系：組合的生物標志物

3　討論

IPF主要發生于老年人，IPF的診斷主要依賴HRCT和（或）肺活檢組織病理學，2011年3月美國呼吸危重癥雜志全文發表的由美國胸科學會（ATS）、歐洲呼吸學會（ERS）、日本呼吸學會（JRS）和拉丁美洲胸科學會（ALAT）共同制定的特發性肺纖維化（IPF）診治指南［1］。指南中將HRCT影像學所見作為診斷IPF最重要診斷依據，對經支氣管肺活檢（TBLB）和支氣管肺泡灌洗（BAL）等檢查方法的評價，多數IPF患者的診斷評估不建議使用TBLB。對于HRCT表現為非典型UIP、無法進行外科肺活檢或無法獲得有效標本而疑診為IPF的患者，通過檢測肺纖維化生物標記物對于肺纖維化的診斷、疾病活動度、嚴重程度及預后評價可能起到重要作用。

KL-6為Ⅱ型肺泡細胞表面抗原，是一種高分子量黏蛋白，1985年由Kohno et al發現，其基因屬于MUC1家族［1］。特發性肺纖維化患者外周血中的血清標志物，如SP-A、SP-D、MMP-7、CCL-18等對IPF患者是有效的預測結果［9］。目前國際上對IPF生物標記物的研究較多，特別是日本，在臨床上SP-A和SP-D可作為間質性肺疾病診斷和預測的有效指標［10］。Kinder et al［11］分析了一組82例外科肺活檢確診的IPF中血清SP-A、SP-D的濃度與病死率之間的相關性，血清SP-A可以早期預測IPF的病死率。許多血清生物標志物的水平是一個連續的變量，需要進行多次檢測和統計分析，以確定對應的截斷值。但目前關于血清標志物在IPF的診斷及疾病進展的研究尚不明朗。已有報道［9］KL-6、SP-A、SPD及MMP-7對IPF的診斷、判斷疾病的活動性有一定的價值。然而，既往報道對每種標記物的研究是獨立進行的，有關IPF疾病活動性標志物的研究尚不完善，也還沒有關于IPF疾病活動性的明確定義，本文為了進一步解釋血清KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7在診斷及疾病進展中的作用，將這四種標記物同時研究并進行對比分析。

本研究使用ELISA法檢測KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7的水平，其數據經統計學處理，對血清標記物水平按利用ROC曲線，KL-6的最佳截斷值為723.0 U/ml，SP-A為67.2 ng/ml，SP-D為98.1 ng/ ml，MMP-7為10.1 ng/ml。KL-6診斷的敏感性、特異性為71.1%、98.7%；SP-A為81.6%、97.4%；SPD為81.6%、97.4%；MMP-7為68.4%、98.7%。在IPF患者中血清SP-A及SP-D的敏感性最高，與血清KL-6及MMP-7相比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。聯合任意兩種或三種血清標志物的敏感性均高于單一血清標志物（除外KL-6聯合MMP-7），但低于聯合四種血清標志物的敏感性。聯合KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7四種血清標志物的敏感性為100%，與單一血清指標比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

IPF患者病情進展表現為呼吸道癥狀增加、肺功能結果惡化、HRCT上纖維化進展、急性呼吸衰竭或死亡。目前有關IPF疾病進展的標志物的研究尚不完善，也還沒有關于IPF疾病活動性的明確定義［12］。IPF急性加重（AEIPF）是指IPF患者出現的急劇的（30 d內）、原因不明的臨床明顯惡化，其可以在IPF慢性過程中隨時出現，與IPF的基礎病情嚴重程度無關，病情兇險，進展迅速，病死率高，預后極差。有關預計和監測AEIPF的生物標志物研究已引起國內外臨床醫師及研究者的關注。而本次研究顯示IPF患者血清中SP-A與MMP-7水平的高低與FVC在6個月內減少的程度呈顯著的相關性，血清SP-A與MMP-7的組合預測疾病進展比任單一生物標志物更好：在IPF患者中高水平的血清SP-A與MMP-7（SP-A≥67.2 ng/ml、MMP-7≥10.1 ng/ml）提示患者有較高頻率（28.5%）的肺功能下降（在6個月內FVC減少10%以上）。而血清SP-A與MMP-7水平均處于低水平的的患者，其肺功能下降的頻率為4.6%。肺功能改變可在一定程度上反應IPF患者疾病進展的情況，IPF患者血清SP-A與MMP-7水平的升高可提示患者肺功能下降幅度增大，進而對疾病進展的的預測有一定意義。

綜上所述，在IPF患者的診斷中，KL-6、SP-A、SP-D及MMP-7四種血清標志物聯合檢測可提高IPF患者早期診斷的敏感性。聯合血清中SP-A和MMP-7水平可提高對IPF患者肺功能改變判斷的準確性，對疾病進展的的預測有一定意義。但該結論還需大規模的研究證實。

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The diagnostic significance of KL-6，SP-A，SP-D and MMP-7 in IPF and its relationship with pulmonary function

Lu Wei1，Zhao Hui1，Wei Hong2
（1Dept of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Dept of Out-Patient，Electronic Engineering Institute of PLA，Hefei 230001）

Objective To investigate the significance of serum krebs Yon den lungen-6（KL-6），surfactant protein A（SP-A），surfactant protein D（SP-D）and matrix metalloprotease 7（MMP-7）in the diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis（IPF）and its relationship with pulmonary function.Methods Serum levels of KL-6，SP-D，SP-A and MMP-7 were detected by ELISA in 38 patients with IPF and serum from 38 patients with pneumonia and 38 normal controls.Serum levels of markers were further analyzed by operating characteristic curve receiver（ROC），from which the ideal level of each serum marker was obtained，and the follow-up of 6 months in patients with IPF. Explore the significance of the diagnosis of IPF and its correlation with pulmonary function.Results The expression of MMP-7，SP-A，SP-D and KL-6 in serum of IPF patients was higher than that in the control group and healthy control group（P＜0.05）.The optimal cutoff value of KL-6 was 723.0 U/ml，SP-A was 67.2 ng/ml，SPD was 98.1 ng/ml，and MMP-7 was 10.1 ng/ml.The sensitivity of KL-6 was 71.1%and 98.7%，SP-A was 81.6%and 97.4%，SP-D was 81.6%and 97.4%，MMP-7 was 68.4%and 98.7%.The sensitivity of combined KL-6，SP-A，SP-D and MMP-7 four serum markers was 100%，compared with a single serum index，the P value was less than 0.05，with statistical significance.IPF patients serum SP-A，MMP-7 and forced vital capacity within 6 months were significantly correlated（r1=-0.574，P1＜0.001；r2=-0.465，P2=0.003）.Conclusion KL-6，SP-A，SP-D and MMP-7 were highly expressed in serum of patients with IPF，and in the diagnosis of IPF，combined detection of 4 serum markers can improve the early diagnosis of IPF patients.Combined serum SP-A and MMP-7 levels can improve the accuracy of the IPF patients with pulmonary function changes，the prediction of disease progression has a certain significance.

idiopathic pulmonary fibrosis；KL-6；SP-A；SP-D；MMP-7；ELISA

R 563.9

A

1000-1492（2016）06-0868-05

2016-04-06接收

安徽省自然科學基金（編號：1508085MH192）

1安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，合肥 2306012合肥電子工程學院門診部，合肥 230001

魯 未，女，碩士研究生；趙 卉，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhaohuichenxi@126.com