戶太八號葡萄酒優勢釀酒酵母的選育研究

葛含靜，楊苗苗（陜西學前師范學院生物科學與技術系，陜西西安710100）

戶太八號葡萄酒優勢釀酒酵母的選育研究

葛含靜，楊苗苗
（陜西學前師范學院生物科學與技術系，陜西西安710100）

為得到西安地區特有葡萄品種——戶太八號自然發酵過程中的優勢釀酒酵母菌株，首先利用YEPD培養基從其自然發酵各時期的醪液中篩選得到155株酵母菌，再利用WL營養瓊脂培養基進行表型鑒定，得到102株釀酒酵母。再經發酵性能和耐受力（酒精度、糖濃度、酸濃度、SO2濃度）的測定，菌株NJ7的發酵指標最好，以其小試發酵戶太八號桃紅葡萄酒，酒液理化指標與感官評價都優于商品化釀酒酵母D254，具備工業化發酵應用潛力。

釀酒酵母；發酵性能；耐受力

葡萄酒香氣成分多達上千種，其中400多種是由酵母菌發酵產生［1］。不同的酵母菌作用各不相同，使葡萄酒具有不同的風味特征，賦予葡萄酒不同的品質及風味，它們是決定葡萄酒質量的重要因素之一［2-3］。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是葡萄酒釀造過程中的主要微生物，可修正酒精發酵過程中的香氣成分，還可產生特殊的發酵香氣［4］。各種葡萄酒發酵過程中接種的釀酒酵母不同，因而代謝途徑有所差異，發酵香氣也不同，具有獨特的游離香氣，使葡萄酒具有各自獨特的香氣特征［5-7］。然而目前，許多葡萄酒企業大量使用進口活性釀酒酵母，如此一來，雖然葡萄酒的發酵速率和產品質量得以穩定，卻導致產品品質同質化嚴重，大大降低了本土釀酒酵母對葡萄酒香氣成分的貢獻［8-9］。

西安地區具有規模化的葡萄種植基地，蘊藏著豐富的本土酵母資源。戶太八號是西安地區特有的葡萄品種。通過對其自然發酵過程中釀酒酵母特性的研究，選育出優勢釀酒酵母菌種，從而為生產地域特色的葡萄酒提供良好的菌種保證。

1　材料

1.1材料

2013年9月中旬從西安市白鹿原葡萄產區采集成熟的戶太八號葡萄果實，自然釀造制酒；商品釀酒酵母D254。

1.2培養基

富集培養基［10］：葡萄糖5%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.25%，MgSO4·7H2O 0.1%，FeSO4·7H2O 0.01%，酵母膏0.05%，滅菌后加Na2SO330 mg/L。如制固體培養基，加瓊脂2%。

分離培養基（YEPD培養基）：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。如制固體培養基，加瓊脂2%。保藏培養基與活化培養基同分離培養基。

WL營養瓊脂培養基［11］：酵母浸粉0.4%，蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%。無機鹽類：KH2PO40.055%，KCl 0.042 5%，CaCl20.0125%，MgSO40.0125%，FeCl30.002 5%，MnSO40.000 25%，溴酚綠22 mg/L，pH5.5。

所有培養基均在121℃高壓滅菌15 min后備用。

2　方法

2.1釀酒酵母的篩選

將成熟度良好的戶太八號葡萄破碎，裝入2個2 L滅菌的發酵瓶中，每瓶裝1 200 mL，25℃自然發酵，其中一瓶加入40mg/L SO2作對照，做2組平行試驗。在發酵的前、中、后期分別量取酒樣10mL，加入到100mL液體富集培養基中，25℃、170 r/min培養24 h，用無菌生理鹽水按不同濃度梯度稀釋，吸取0.2 mL，均勻涂布于分離培養基平板，25℃培養72 h，選擇菌落生長良好且密度適宜的平板，隨機挑取10個～20個單菌落進行轉接，并多次劃線培養以獲得純酵母菌株，保藏于試管斜面，4℃冰箱保存。

將保藏的酵母菌種接種于5 mL YEPD液體培養基，25℃、170 r/min活化24 h，劃線接種于WL營養瓊脂培養基，25℃培養72 h，觀察并記錄單菌落特征。根據釀酒酵母在WL營養瓊脂培養基上的特殊的菌落特征，篩選出釀酒酵母。

2.2優勢釀酒酵母的篩選

初篩：向大試管中加入杜氏發酵管，再加入25 mL新鮮戶太八號葡萄汁，滅菌后接入活化的釀酒酵母，并加入40 mg/L SO2，25℃培養。以杜氏管法測定發酵菌株的起酵時間、氣味、發酵力以及凝聚性，作為發酵性能的指標。以空白作對照。

復篩：向1 L新鮮戶太八號葡萄汁接入3%初篩菌株種子液，并加入40 mg/L SO2，定時搖瓶，25℃恒溫培養。以12 h為時間間隔進行稱重，直到恒重（失重小于0.2 g/d）即停止發酵。以酒香、酒精度、總酸、凝聚性、總糖以及發酵力作為復篩指標。以空白作對照。

2.3釀酒酵母的耐受力測定

按3%接種量分別向不同無水乙醇濃度（6%、9%、 12%、15%、18%，體積分數）、SO2濃度（50、100、150、200、250 mg/L）、酒石酸濃度（8%、10%、12%、15%、20%）和葡萄糖濃度（100、200、300、400、500 g/L）的10 mL戶太八號葡萄汁中接入活化的釀酒酵母菌液，25℃培養48 h，以杜氏管法測定酵母的耐受力。按3%接種量接入復選的酵母菌液，分別于10、15、20、25、30、35℃做發酵試驗，全程定時測定發酵速率。以商品化酵母D254為對照。

2.4小試發酵生產戶太八號桃紅葡萄酒

在裝有10 L新鮮戶太八號葡萄漿果的發酵罐中按1.0%接種量接種釀酒酵母，篩選出優勢菌株，并加入40 mg/L的SO2，25℃溫度條件下發酵5 d后進入終止期，酒樣經5 000 r/min離心后，測定酒精度、總酸、總糖、單寧、色度、花色苷和總酚的含量；以葡萄酒的滋味、澄清度、酒體香氣和酒體的色澤作為葡萄酒的感官指標。以D254作對照。

3　結果與討論

3.1釀酒酵母的篩選與鑒定

將從戶太八號葡萄酒自然發酵過程中篩選的155株酵母菌接種于WL營養瓊脂培養基，培養72 h后，篩選出102株在WL營養瓊脂培養基平板上呈奶油色，略帶淡綠，球形突起，表面光滑，不透明的菌株，具有典型釀酒酵母的形態特征。

大量文獻表明，WL營養瓊脂培養基對葡萄酒自然發酵過程中的絕大多數酵母菌具有很好的鑒別力［12-15］。更有文獻表明，WL營養瓊脂培養基對釀酒酵母的鑒別準確度可達100%［16-18］。為了進一步驗證鑒定的準確性，從102株上述菌株中隨機挑選3株進行5.8S ITS序列鑒定，確定為釀酒酵母。綜上，可以確定，通過WL營養瓊脂培養基篩選出的102株酵母菌為釀酒酵母。3.2優勢釀酒酵母的篩選

對102株釀酒酵母進行初篩，選出起酵快、繁殖力強、發酵性能良好的釀酒酵母菌株NJ1、NJ3、NJ7、NJ12、NJ24共5株，結果見表1（略去棄用的150株酵母菌初篩指標）。

表1　優勢釀酒酵母初篩結果Table 1　The results of primarily screening for good Saccharomyces cerevisiae

將這5株酵母進行復篩，結果見表2。

可以看出：SO2對NJ1和NJ24有明顯的抑制作用，且它們產酒香氣一般，殘糖量大，故棄用；NJ12殘糖量較大，可能是生長代謝過程中受到了SO2和酒精的抑制，亦棄用；選擇殘糖量低、酒精度高、發酵力強和產酒香氣良好的NJ3和NJ7為最終復篩菌株。

表2　 優勢釀酒酵母復篩結果Table 2　The results of re-screening for good Saccharomyces cerevisiae

3.3復篩釀酒酵母的耐受性能比較

3.3.1酒精耐受試驗

接種16 h后，酒精度對菌株NJ7與D254發酵延遲時間影響不大，但菌株NJ3酒精耐受性能較差，見圖1。

圖1　復篩釀酒酵母酒精濃度耐受試驗Fig.1　Alcohol tolerance tests for re-screening strains and contrast strain D254

由圖1可知，酒精度為18%時，發酵完全被抑制；酒精度為15%時，NJ7與D254有極為緩慢的發酵；酒精度在9%～12%時，發酵速率急劇下降；酒精度在6%～9%時，對發酵速率影響不大。工業化葡萄酒釀造過程中酒精度一般為10%～13%，3株菌在此酒精度時均能夠持續發酵［19］。

3.3.2糖濃度耐受試驗

3株釀酒酵母均有較廣的糖濃度耐受范圍，見圖2。

圖2　復篩釀酒酵母糖濃度耐受試驗Fig.2　Sugar tolerance tests for re-screening strains and contrast strain D254

由圖2可知，糖濃度在100 g/L～300 g/L區間，發酵速率均顯著降低；當含糖量增加到400 g/L時，發酵延遲，發酵速率減緩，發酵時間增加，發酵受到了明顯的抑制；糖濃度為500 g/L時，發酵現象均不明顯，發酵受到進一步抑制。因此，3株菌糖耐受性都良好。

3.3.3酒石酸耐受試驗

3株釀酒酵母均有較強的酸耐受性能，見圖3。

圖3　復篩釀酒酵母酒石酸濃度耐受試驗Fig.3　Tartaric acid tolerance tests for re-screening strains and contrast strain D254

由圖3可知，3株菌起酵時間基本一致；隨著酒石酸濃度逐漸增加，3株菌發酵速率均呈逐漸降低趨勢；當酒石酸含量在10 g/L～12 g/L時，發酵速率降幅最大。因此，3株酵母的酸耐受性能都較強。

3.3.4SO2耐受試驗

3株釀酒酵母對SO2均有較好的耐受性，見圖4。

圖4　復篩釀酒酵母SO2濃度耐受試驗Fig.4　SO2tolerance tests for re-screening strains and contrast strain D254

由圖4可知，SO2濃度在50 mg/L～150 mg/L時，起酵時間均隨SO2濃度升高而增長，但發酵速率均呈降低趨勢；SO2濃度在100 mg/L～150mg/L時，發酵速率急劇降低；SO2濃度達到200 mg/L時，發酵受到明顯抑制，發酵速率進一步降低，NJ3發酵速率降幅更快；當SO2濃度為250 mg/L時，發酵幾乎完全被抑制；NJ3耐SO2性能較差，其發酵受SO2濃度影響比較明顯。然而，SO2在葡萄汁中添加量一般為60 mg/L，3株菌在此SO2濃度下均可持續發酵［20］。

3.3.5溫度對發酵速率的影響

3株釀酒酵母的發酵溫度范圍均較寬，見圖5。

圖5　復篩釀酒酵母發酵溫度試驗Fig.5　Fermentation temperature tests for re-creening strains and contrast strain D254

由圖5可知，在10℃～35℃溫度區間，3株菌均能發酵；10℃時發酵較慢，隨著溫度逐漸上升，發酵速率均呈上升趨勢，在25℃時達到最高，之后陡然下降；在25℃～30℃時，發酵周期相對較短。故，3株菌均有較寬的發酵溫度范圍，可耐受較高溫度。

綜合4個耐受性試驗和不同溫度下發酵性能試驗的結果可知：酵母菌種NJ7在酒精耐受試驗、耐糖試驗、耐酸試驗及SO2耐受試驗中，綜合耐受性能接近D254；釀酒酵母NJ3在耐糖及耐酸方面與NJ7和D254不相上下，但在耐酒精和耐SO2方面明顯低于NJ7和D254，故棄用NJ3。最終確定NJ7為優勢戶太八號葡萄酒釀酒酵母。

3.4小試發酵生產戶太八號桃紅葡萄酒

釀酒酵母NJ7和D254所釀葡萄酒的理化指標測定結果見表3，感官評定結果見表4。

表3　葡萄酒理化指標Table 3　Properties of wine

表4　葡萄酒感官評定Table 4　Sensory evaluations of wine

由表3和表4可知：釀酒酵母NJ7與D254發酵所得葡萄酒各項理化指標差異不太顯著，除菌株NJ7發酵后酒樣的色度和花色苷含量略低于商品酵母D254發酵的酒樣，其余理化指標均高于D254發酵的酒樣；兩者感官評定基本一致。綜合分析各指標結果，菌株NJ7的發酵葡萄酒參數高于商品化酵母D254，具有產業化應用價值。

4　結論

從西安產區戶太八號葡萄自然發酵醪液中優選出了釀酒酵母NJ7，用于戶太八號桃紅葡萄酒釀造試驗，結果顯示釀酒酵母菌株NJ7發酵酒樣參數較好，香氣濃郁，各項指標接近商品化釀酒酵母，具備工業化葡萄酒釀造應用潛力。

［1］De Lerma N L，Peinado R A.Use of two osmoethanol tolerant yeast strain to ferment must from Tempranillo dried grapes effect on wine composition［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，145：342-348.

［2］ Viana F，Belloch C，Vallés S，et al.Monitoring a mixed starter of Hanseniaspora vineae-Saccharomyces cerevisiae in natural must：Impact on 2-phenylethyl acetate production［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，151：235-240

［3］Ye M，Yue T，Yuan Y，et al.Production of yeast hybrids for improvement of cider by protoplast electro fusion［J］.Biochemical Engineering Journal，2013，81：162-169

［4］Li X，Chan L J，Yu B，et al.Fermentation of three varieties of mango juices with a mixture of Saccharomyces cerevisiae and Williopsis saturnus var.mrakii［J］.International Journal of Food Microbiology，2012，158：28-35

［5］Comitini F，Gobbi M，Domizio P，et al.Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae［J］.Food Microbiology，2011，28：873-882

［6］Varela C，Torrea D，Schmidt S A，et al.Effect of oxygen and lipidsupplementation on the volatile composition of chemically defined medium and Chardonnay wine fermented with Saccharomyces cerevisiae［J］.Food Chemistry，2012，135：2863-2871

［7］ Herrero O，Ramon D，Orejas M.Engineering the Saccharomyces cerevisiae isoprenoid pathway for de novo production of aromatic monoterpenes in wine［J］.Metabolic Engineering，2008，10：78-86

［8］劉天明，王可，李記明，等.天然酵母菌株對赤霞珠葡萄酒香氣構成的影響［J］.中國釀造，2010（11）：171-174

［9］苑偉，王學鋒，劉延琳.優選釀酒酵母菌株發酵性能研究［J］.中國釀造，2010（9）：48-52

［10］王慧，張立強，劉天明，等．產地葡萄酒優良酵母菌株的篩選及鑒定［J］．釀酒科技，2007（9）：29-34

［11］Cavazza A，Grando M S，Zini C.Rilevazione della flora microbica dimostie vini［J］.Vignevini，1992，9：17-20

［12］程仕偉，韓鵬，趙慧，等．赤霞珠葡萄自然發酵過程中的釀酒酵母篩選及其發酵特性［J］．釀酒科技，2015（3）：16-19

［13］劉興艷，潘軍，顧一洪，等．四株野生酵母菌株耐受性的研究［J］．食品工業科技，2015（1）：151-155，167

［14］張珍，韓舜愈，王婧，等．祁連葡萄酒產區葡萄酒相關野生酵母菌株的分離及初步分類［J］．食品工業科技，2013（8）：179-182

［15］李雙石，陳晶瑜，韓北忠，等．中國本土葡萄酒酵母種群多樣性分布的研究進展［J］．中國釀造，2011（12）：4-8

［16］楊瑩，徐艷文，薛軍俠.WL營養瓊脂對葡萄酒相關酵母的鑒定效果驗證［J］.微生物學雜志，2007，27（5）：75-78

［17］薛軍俠，徐艷文，楊瑩.WL培養基在釀酒酵母篩選中的應用［J］.中國釀造，2007（9）：36-39

［18］趙靜靜，李艷.沙城產區釀酒酵母多樣性研究［J］.食品科學，2012，33（5）：224-228

［19］Biasi R，Deiana M，Guina T，et al.Wine consumption and intestinal redox homeostasis［J］.Redox Biology，2014，2：795-802

［20］Christ K L，Burritt R L.Critical environmental concerns in wine production：an integrative review［J］.Journal of Cleaner Production，2013，53：232-242

Screening of Good Saccharomyce scerevisiae from Wine Fermented with No.8 Hutai Grapes

GE Han-jing，YANG Miao-miao （Department of Biology Science and Technology，Shaanxi Xueqian Normal University，Xi'an 710100，Shaanxi，China）

In order to screen good Saccharomyce scerevisiae strain from spontaneous fermentation with No.8 Hutai Grape，which was the unique species in Xi'an.Firstly，155 yeasts strains were isolated with Yeast Extract Peptone Dextrose medium（YEPD medium）during spontaneous fermentation.And then，102 Saccharomyce scerevisiae strains were screened on Wallerstein Laboratory Nutrient Agar（WL agar）by phenotypic identification.Finally，strain NJ7 was screened as good Saccharomyce scerevisiae by tests of fermentation characteristics and tolerance to alcohol，sugar，acid and SO2.Additionally，small-scale volume production of No.8 Hutai wine with strain NJ7 was carried out.The results showed that the wine sample made by strain NJ7 had even better properties and sensory evaluations than the commercial yeast D254，so has potential applications in wine brewing industry.

Saccharomycescerevisiae；fermentationcharacteristics；tolerance

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.045

陜西學前師范學院博士研究生科研專項項目（2014DS001）；陜西省科技廳自然科學基礎研究計劃項目（2016JQ3036）；陜西省科技廳農業科技創新與攻關項目（2016NY-204）

葛含靜（1981—），女（漢），講師，博士，研究方向：糧食工程與發酵技術創新。

2015-04-09