沙門菌定性檢驗方法的關鍵環節分析

郭曉煥駐馬店市食品藥品檢驗所，河南駐馬店　463000

沙門菌定性檢驗方法的關鍵環節分析

郭曉煥
駐馬店市食品藥品檢驗所，河南駐馬店463000

目的探究沙門菌定性檢驗方法的關鍵環節。方法選取駐馬店市食品藥品檢驗所2015年1月—2016年2月間以“食品藥品鑒定系統能力驗證計劃”所提供的15件考核樣品為對象，針對原始標本，利用BPW進行前增菌，采用TTB和SC實施二次增菌。基于此，通過3種分離培養基，鑒定分離培養。同時，通過實時熒光PCR方法，對比分析前增菌和二次增菌后的增菌效果。結果基于分離培養方法作用下，15件考核樣品中有12件樣品可檢測到沙門菌。基于實時熒光PCR檢測方法作用下，15件考核樣品中有14件樣品可檢測到沙門菌。結論在優化沙門菌檢測方案的基礎上，特別是篩查大規模樣本或監測時，前增菌后直接進行檢測，或者利用SC二次增菌后鑒定分離培養，有助于減少工作量，減低資源浪費。

沙門菌；檢驗方法；關鍵環節

［Abstract］Objective To explore the key qualitative test method of salmonella.Methods Zhumadian City Food and drug inspection and the January 2015— Fcbrnany 2016 are provided by the food and drug identification system capacity verification plan 15 examination sample selection as the object，the original specimens，use BPW of pre enrichment and using TTB and SC implementation secondary enrichment.Based on this，through three kinds of separation medium，were isolated and identified.At the same time，by real-time fluorescent quantitative PCR，analysis and comparison to increase bacteria and secondary enrichment increased bacterial.Results Based on the methods of isolation and culture under the action of 15 assessment samples of 12 samples were detected salmonella.Based on the method of real-time fluorescence PCR detection under the 15 assessment samples of 14 samples were detected salmonella.Conclusion In Salmonella detection scheme based optimization，especially large-scale screening of samples or monitoring，pre enrichment direct detection，or using SC second increase bacteria isolation and identification of culture，it can help to reduce the workload and reduce the waste of resources.

［Key words］Salmonella；Test method；Key link

目前，全球食源性疾病呈現出日漸流行趨勢，致使食品完全問題逐漸得到社會各界的關注與重視，然而，沙門菌是導致食源性疾病的關鍵致病菌，且檢測方案的可行性與監測敏感性存在密切聯系。針對我國，衛生部行業標準（即行標）和國家標準方法GB/ T4789.4-2010（即國標）是沙門菌分離鑒定的兩大方法［1］。其中，行標主要用于檢測臨床標本，國標主要用于檢測食品來源標本。對于國標，需對檢測標本實施二次增菌，且需以2個溫度條件和2種增菌液為前提，具有操作復雜等特點［2］。鑒于此，如何提高實驗檢測效率，優化實驗關鍵環節，成為學者研究的話題。為此，此文選取駐馬店市食品藥品檢驗所2015年1月—2016年2月以 “食品藥品鑒定系統能力驗證計劃”所提供的15件考核樣品為對象，對比分析了沙門菌檢驗方法，取得了一定成效，現將相關報道如下。

1　資料與方法

1.1樣品

以“食品藥品鑒定系統能力驗證計劃”所提供的15件考核樣品為對象，所以樣品均為凍干狀，是一種白色微球，且3 mm左右是其直徑。

1.2儀器與試劑

①儀器：熒光定量PCR儀；②試劑：緩沖蛋白胨水；四硫酸鈉煌綠增菌液；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液；木糖賴氨酸膽酸鹽瓊脂；亞硫酸鉍；三糖鐵瓊脂；科瑪嘉沙門顯色瓊脂；診斷血清；VITEK生化試劑。

1.3方法

1.3.1細菌分離培養鑒定 在PT要求指導下，以國標方法為依據，開展檢驗工作。①前增菌：基于無菌操作下，取BPW1ml，待完全溶解樣品后，將BPW添加至10 mL，以36℃1℃為基準，8～18 h為培養時間。②增菌：輕輕晃動經培養的樣品混合物，取1 mL放置于10 mLTTB中，以42℃1℃為基準，18～24 h為培養時間。與此同時，取1 mL放置于10 mLSC中，以36℃1℃為基準，18～24 h為培養時間。③分離：各取1環上述2種增菌液，分別放置于BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板和CAS顯色平板上，基于36℃1℃下，培養18～24 h。對平板上的菌落生長狀況、典型菌落形態進行觀察。④生化試驗：分別挑取2個以上的典型或可疑菌落，將其接種于三糖鐵瓊脂上，在斜面劃線基礎上，進行底層穿刺。針對接種針，可不滅菌，直接將其接種于營養瓊脂平板上，以36℃1℃為基準，18～24 h為培養時間。基于營養瓊脂平板下，對可疑菌落進行挑取，以VITEK2 Compact操作手冊為指導，開展試驗工作，并對結果進行判定。若符合生化三塘初篩，則利用VITEK系統，實施生化鑒定。在此基礎上，借助沙門多價血清凝集實驗，對最終結果進行判定。

1.3.2實時熒光PCR方法 ①制備模板DNA：取1 mL每種增菌液，以8 000 rpm/min為指標，離心5 min，待除去上清后，添加DEPC1mL，并洗滌沉淀。以8000rpm/min為指標，離心5 min，待除去上清后，添加100DEPC水，基于沸水下，進行10 min的加熱。以12 000 rpm/min為指標，離心10 min，待除去上清后，以供備用。②熒光PCR反應：12.52PCR反應混合物屬于25反應體系范疇，0.2為上、下游引物，2為模板DNA。PCR反應條件：基于95℃下10 min，95℃下15 s，60℃下1 min，以40個循環為標準。每一樣本均表現出S型擴增曲線，其菌液濃度隨著Ct值的增加而減小。同時，Ct值處于10～35范圍內，標志著診斷為陽性，反之，則為陰性。

1.4統計方法

2　結果

2.1分離培養方法檢測結果

通過BPW前增菌，所有培養液表現出不同程度上的混濁現象，說明存在菌落。通過TTB和SC二次增菌，相較于前增菌，樣品的培養管差異無統計學意義。然而，15件樣品中有12件樣品存在典型菌落。樣品種菌落分布，見表1。

表1　樣品種菌落分布

2.2基于前增菌和二次增菌條件下，對比2種增菌液增菌效果

針對不同增菌液二次增菌后增菌效果，如表2所示。

表2　不同增菌液二次增菌后增菌效果對比

3　討論

沙門菌，是一種食源性致病菌，較為常見。目前，國標檢測屬于常用的檢測方法，其需較長的檢測時間，一般情況下，需4～5 d，且需滿足2種增菌液和2個溫度培養條件，大大增加了人力、物力和材料的耗費［3］。

此研究以 “食品藥品鑒定系統能力驗證計劃”所提供的15件樣品為對象，樣品來源具有較強的可靠性，在確定初始濃度的前提下，為準確評價增菌條件提供存在濃度差異的樣品。同時，此研究利用熒光PCR檢測方法［4］對2種菌液增菌效果進行有效評價，在檢測細菌DNA精確定量的基礎上，對菌液的濃度和增殖效率進行正確反映，其靈敏度、特異性與可靠度均較高，相較于傳統分離培養方法，其具有有效區分增菌效果差異的作用。與其他相關報道［6］結果基本一致，該占比達到72.13%。

一般而言，食品樣品自身存在物理性質，且蘊藏一定量的致病菌，加之受到諸多雜菌影響，易導致常規檢測結果存在誤差，影響檢測正確率。基于BPW作用下［7］，對樣品實施富集增菌培養，以達到維持或降低增菌液中pH值的目的，控制雜菌迅速生長繁殖，促使靶菌得以增殖。然而，針對受到物理損傷的樣品，例如，冷傷、輻射等，其菌體修復增殖效果并不顯著，只有通過二次增菌，例如，TTB、SC等，以滿足沙門菌平板分離的靈敏度需求［8］。

提高沙門菌檢測敏感度的關鍵在于有效增菌，對于食物中毒溯源的病原菌，通過前增菌后直接檢測，促使其更具科學性與實用性［9］。因為，食物中毒案例中所涉及的留樣食品，其與受到低污染的自然食品存在差異，其含有大量致病菌，增加檢測難度［10］。此研究樣板數量較少，導致研究存在局限性。因此，為提高沙門菌檢測質量，還需相關人員進一步研究沙門菌定性檢測方法的關鍵環節。

［1］孫康德，李潔瓊，陳福祥，等.食源性沙門菌感染的實驗室診斷及鼠傷寒沙門菌同源性分析 ［J］.檢驗醫學，2012，27（11）：913-916.

［2］武利平.光纖倏逝波生物傳感器快速檢測水中沙門菌和腸炎沙門菌的方法研究［D］.北京：中國疾病預防控制中心，2014.

［3］張秀芹.飼料中沙門菌快速檢測方法的建立及其分離株的耐藥性與致病性分析［D］.長春：吉林大學，2014.

［4］鄭秋月，戰曉微，肖珊珊，等.沙門氏菌MALDI-TOF MS分型方法建立［J］.中國公共衛生，2014，30（10）：1344-1347.

［5］於穎，王文靜，陸曄.PMA-qPCR定量檢測畜禽肉類中沙門菌活菌的研究［J］.檢驗醫學，2015，30（05）：500-506.

［6］曲梅，張新，呂冰，等.沙門菌定性檢驗方法關鍵環節評價［J］.中國衛生檢驗雜志，2014（19）：2743-2745，2749.

［7］祝儒剛，宋立峰.肉及肉制品中沙門氏菌活細胞的PCR檢測研究［J］.食品科學，2012.33（16）：199-203.

［8］王宇，靳偉東，蘭凱，等.熒光定量PCR技術在臨床微生物檢測中的應用［J］.中國衛生標準管理，2015，6（30）：151-152.

［9］程潔萍，譚翰清，朱穎梅.TaqMan探針實時熒光PCR快速檢測奶粉中沙門氏菌的研究［J］.中國熱帶醫學，2015，15（10）：1165-1168.

［10］潘玉輝，李玉，蔡秀芝，等.幾種主要食源性致病菌熒光定量PCR快速檢測方法的建立［J］.醫學信息，2015，28 （25）：78-79.

Analysis of Key Qualitative Test Method of Salmonella

GUO Xiao-huan
Zhumadian Municipal Food and Drug Inspection Institute，Zhumadian，Henan Province，463000 China

R378

A

2096-1782（2016）07-0123-03

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.07.123

郭曉煥（1974.11-），女，河南駐馬店人，本科，微生物檢驗技術中級，專業方向：微生物檢驗。

2016-04-05）（

2016-04-05）