表皮生長因子受體對乙醇所致肝細胞損傷中脂肪酸合酶表達的影響

趙　剛， 董　蕾， 李　紅， 史海濤， 秦　斌， 趙紅莉， 魯曉嵐

(西安交通大學第二附屬醫院消化內科，西安　710004； *通訊作者，E-mail: dong556@126.com)

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表皮生長因子受體對乙醇所致肝細胞損傷中脂肪酸合酶表達的影響

趙剛， 董蕾*， 李紅， 史海濤， 秦斌， 趙紅莉， 魯曉嵐

(西安交通大學第二附屬醫院消化內科，西安710004；*通訊作者，E-mail: dong556@126.com)

目的觀察乙醇所致原代培養小鼠肝細胞損傷中脂肪酸合酶(FASN)的表達情況，探討表皮生長因子受體(EGFR)在此過程中可能的作用。方法常規原代培養小鼠肝細胞，隨機分為對照組(生理鹽水組)、乙醇組、Gefitinib組及Gefitinib加乙醇組，收集并測定細胞裂解液中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性和丙二醛(MDA)濃度；提取細胞總RNA及蛋白質，分別采用real time-PCR及Western blot方法檢測FASN、固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBP-1c)及p-EGFR的基因及蛋白的表達。結果經150 mmol/L乙醇作用10 h的小鼠原代培養肝細胞貼壁生長狀況變差，與對照組比較，細胞裂解液中ALT、AST活性及MDA濃度顯著上升(P<0.01)，出現肝細胞損傷。與對照組比較，Gefitinib組肝細胞的FASN、SREBP-1c及EGFR在基因及蛋白水平均無明顯變化(P>0.05)，乙醇組肝細胞的FASN、SREBP-1c及p-EGFR在基因及蛋白水平表達豐度均明顯升高，其差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與乙醇組比較，Gefitinib加乙醇組肝細胞中FASN及SREBP-1c的基因及蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，其p-EGFR mRNA的表達量仍處于高值，但差異無統計學意義(P>0.05)，而其蛋白表達水平出現顯著下降(P<0.05)。結論FASN在正常肝細胞中僅微量表達，而在乙醇所致肝損害的肝細胞中呈高表達，其表達水平可能受EGFR調節。

表皮生長因子受體；酒精性肝損害；脂肪酸合酶；酪氨酸激酶抑制劑

在我國，酒精是繼病毒性肝炎之后對人體肝臟構成巨大威脅的最重要病因，由于過量酒精攝入所導致的慢性肝病的發病率正呈逐年上升趨勢，酒精濫用及依賴已然成為危害人民健康的公共衛生問題[1]。流行病學資料顯示[2]重度飲酒者中80%以上可出現不同程度的脂肪肝，10%-35%可發展成酒精性肝炎，10%-20%可發展至肝硬化階段，因此，酒精性肝病的防治已成為重要的醫療及公共衛生課題。脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)是促進內源性長鏈脂肪酸合成的關鍵酶，其位于細胞漿內，并主要分布于高脂肪代謝及對激素敏感的組織中，肝臟即為代表性臟器[3]。由于正常機體主要依靠糖類物質供能，因此哺乳動物肝細胞中FASN表達量較低[4]。當機體處于某種特殊狀況，如急性應激、炎癥甚至癌變時[5]，肝臟的脂質代謝水平會明顯升高，以適應內外環境的變化，此時組織及細胞中FASN表達量會有不同程度的變化[6]。表皮生長因子受體及其與相關配體結合后所激活的細胞內信號轉導通路是目前腫瘤學研究的熱點，該信號通路可啟動細胞核內有關基因，從而促進細胞的分裂與增殖[7]。Gefitinib是一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，可選擇性的結合細胞膜內的酪氨酸激酶區域，阻斷酪氨酸激酶與ATP的結合，進而阻斷EGFR信號通路向下游傳導，臨床上被用于治療局部晚期或遠處轉移的非小細胞肺癌[8]。本實驗以體外培養原代小鼠肝細胞為研究對象，探討乙醇所致肝細胞急性損傷模型中，FASN的表達變化情況及表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)可能的調節機制。

1　材料與方法

1.1小鼠及主要試劑與儀器

3-5周齡BALB/c小鼠(SPF級，生產許可證號：SCXK(陜)2012-003)由西安交通大學實驗動物中心提供。DMEM培養基購自美國GIBCO公司；胎牛血清為北京元亨生物工程有限公司產品；胰蛋白酶、TRIzol、二甲基亞砜(DMSO)及細胞裂解液購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)及丙二醛(MDA)檢測試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；Quant One Step qRT-PCR Kit(Probe)試劑盒為北京天根生化科技有限公司產品；PCR引物由上海英駿生物科技有限公司合成。Western blot用HRP化學發光底物為美國Millipore公司產品，β-actin單克隆抗體及其余免疫印跡所需試劑均由北京華肽先鋒生物科技公司提供。OPTICONTM熒光定量PCR檢測系統及Gel DOC型全自動凝膠成像分析系統均為美國Bio-Rad公司產品。所用Gefitinib由揚州大學胡本順博士惠贈。

1.2肝細胞原代培養

根據文獻[9]方法將BALB/c小鼠麻醉后斷頭處死，無菌分離肝組織后剔除包膜及纖維成分，加入預先配置好的消化液(主要成分為胰酶)置4 ℃冰箱過夜消化；去除消化液并加入含10%胎牛血清的DMEM培養液制成肝細胞懸液，再經200目尼龍篩網過濾并離心收集肝細胞，臺盼藍活細胞計數>80%，按5×105/ml密度接種，于37 ℃、5%CO2條件下培養，待細胞貼壁生長后改為5%胎牛血清DMEM培養液繼續培養。

1.3動物分組與處理

60只BALB/c小鼠隨機分為4組:對照組(生理鹽水組)、乙醇組(150 mmol/L)、Gefitinib組(1 μmol/L)及Gefitinib加乙醇組，每組各15只。按照前述肝細胞原代培養方法進行動物的麻醉后處死及肝細胞分離培養，培養至第7天更換培養液時分別給予相應處理措施，繼續培養細胞10 h收集細胞進行裂解并收集裂解液留存或提取細胞總RNA及蛋白質留存待檢。

1.4生化指標測定

將收集到的各組細胞加入裂解液吹打(約100 μl裂解液/200萬細胞)，裂解2 min，10 000 r/min離心10 min，收集裂解液并除去細胞，留取上清液待檢。按照檢測試劑盒說明書分別檢測ALT和AST在上清液中的活性，單位為IU/L。用Lowry法測定細胞內總蛋白含量，再按照硫代巴比妥法檢測上清液中MDA含量，單位用μmol/g蛋白表示。

1.5real time PCR法檢測FASN、SREBP-1c及p-EGFR基因表達

收集細胞后用TRIzol試劑提取細胞內的總RNA，按照Quant One Step qRT-PCR Kit (Probe)試劑盒說明配置qRT-PCR反應液。qRT-PCR步驟為：50 ℃反轉錄30 min，92 ℃起始模板變性3 min，后開始PCR循環，92 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，68 ℃延伸20 s，共42個循環。PCR反應結束后計算機自動繪制標準曲線，擴增曲線及溶解曲線等。

1.6Western blot法檢測FASN、SREBP-1c及p-EGFR蛋白表達

利用Bradford比色法測定前期提取的原代肝細胞總蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品并加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，之后對蛋白樣品進行電泳分離及電轉至PVDF膜；以100 g/L脫脂牛奶對PVDF膜進行封閉過夜；分別加入羊抗鼠FASN、SREBP-1c及p-EGFR抗體(1∶500)作為一抗室溫孵育PVDF膜1 h；以沖洗緩沖液洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶偶聯的牛抗羊IgG(1∶5 000)二抗孵育1 h；再次以沖洗緩沖液洗膜3次，每次10 min；以ECL發光試劑盒曝光顯影；β-actin作為內參照。

1.7統計學分析

2　結果

2.1原代培養肝細胞生長狀況

原代培養小鼠肝細胞約48 h可見大部分細胞貼壁生長，光鏡下肝細胞呈三角形或梭形，排列整齊，細胞界限清晰，胞質豐富透亮。細胞核有單核、雙核，呈圓形或橢圓形，核仁清晰可見。經150 mmol/L乙醇作用10 h的原代肝細胞貼壁狀況明顯變差，圓形或類圓形細胞比例增多，其余各組肝細胞光鏡下形態改變不明顯。

2.2細胞培養裂解液中ALT、AST活性及MDA濃度

與對照組比較,經150 mmol/L乙醇作用10 h細胞裂解液中ALT及AST活性明顯升高，MDA濃度亦顯著上升(P<0.01，見表1)，提示肝細胞損傷。與乙醇組比較，Gefitinib加乙醇組肝細胞裂解液中ALT與AST活性出現顯著下降，MDA濃度亦明顯降低(P<0.05，見表1)，提示Gefitinib對乙醇所致肝細胞損傷具有保護作用。

表1各組細胞裂解液中ALT與AST活性、MDA濃度

Table 1Comparison of ALT, AST and MDA in cell lysates among four groups

組別ALT(IU/L)AST(IU/L)MDA(μmol/g蛋白)對照組74.13±10.3286.04±13.1417.62±1.43乙醇組213.10±19.33**198.15±22.35**52.31±2.60**Gefitinib組85.34±12.2292.03±15.2419.52±1.74Gefitinib+乙醇組101.11±16.20#106.08±17.22#24.82±2.24#

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與乙醇組比較，#P<0.05

2.3FASN、SREBP-1c及p-EGFR基因的表達水平

與對照組比較，原代培養小鼠肝細胞在經乙醇作用后其FASN、SREBP-1c及p-EGFR基因表達水平明顯升高(P<0.01，見圖1)。而Gefitinib加乙醇組肝細胞FASN及SREBP-1c基因表達水平與對照組比較無明顯差異(P>0.05)。Gefitinib加乙醇組的p-EGFR基因表達水平類似于乙醇組，均顯著高于對照組(P<0.01，見圖1)。

2.4FASN、SREBP-1c及p-EGFR蛋白的表達水平FASN、SREBP-1c及p-EGFR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01，見圖2)，而Gefitinib加乙醇組肝細胞中SREBP-1c和p-EGFR蛋白表達水平與對照組比較無明顯差異。與對照組及Gefitinib組比較，Gefitinib加乙醇組的FASN蛋白表達量明顯升高(P<0.05)，但顯著低于乙醇組(P<0.01，見圖2)。

與對照組比較，乙醇組原代培養小鼠肝細胞的

與對照組比較，**P<0.01；與乙醇組比較，##P<0.01圖1　FASN、SREBP-1c及p-EGFR基因的表達水平Figure 1　Gene expression of FASN, SREBP-1c and p-EGFR in four groups

圖2　FASN、SREBP-1c及p-EGFR蛋白的表達水平Figure 2　Protein expression of FASN,SREBP-1c and p-EGFR in four groups

3　討論

不同病因所導致的肝臟炎性改變是各種慢性肝病發生發展的共同基礎，其受到外界侵襲因素或內在循環紊亂、代謝障礙及免疫反應等多重因素的影響[10]。既往研究表明，多種細胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-10(Interleukin-10, IL-10)、胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor-1, IGF-1)、熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)及一氧化氮(nitric oxide, NO)等在肝細胞致炎與抗炎平衡體系中扮演著不同的角色，同時此類細胞因子可能與肝細胞能量代謝相關聯，通過能量代謝調節細胞增生、變性、凋亡及癌變等病理生理過程[11-15]。

FASN是哺乳動物機體內催化內源性長鏈脂肪酸合成的關鍵酶。在正常生理狀況下，哺乳動物機體組織優先利用來自食物中攝取的脂質，內源性脂肪酸合成處于較低水平，因此在正常組織及細胞中FASN不表達或微量表達。本課題組既往的相關實驗表明[5]，體外培養的肝癌細胞HepG2可顯著高表達FASN，而通過抑制FASN表達可達到促進腫瘤細胞凋亡的效果，這些發現與近年來多項其他研究認為的FASN在多種腫瘤組織中異常升高，且其升高水平與惡性腫瘤患者的預后呈負相關的結論相一致[16-18]。FASN在腫瘤性病變發生發展過程中的異常改變得到了學者們的廣泛關注與重視，但在非腫瘤性病變，尤其是在酒精性肝病方面鮮有報道。固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)是調控與脂質代謝相關基因表達的關鍵性核轉錄因子，包括三種亞型，其中SREBP-1c是肝臟脂質代謝的關鍵調控者。本研究發現，經乙醇作用后肝細胞中SREBP-1c表達明顯升高，同時FASN表達亦顯著升高，提示乙醇所致肝細胞損害中SREBP-1c發揮了對FASN基因轉錄與表達的調節作用。

有研究發現，SREBP-1c和FASN與EGFR關系密切。EGFR廣泛存在于哺乳動物的上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞等細胞表面，可分為胞外配體結合區、跨膜區和胞內激酶區。EGFR可通過與表皮生長因子(EGF)或轉化生長因子α(TGF-α)等配體結合而二聚體化，使其中的蛋白酪氨酸激酶活性增強，受體自身的酪氨酸殘基發生磷酸化，這種自磷酸化是細胞內信號轉導的重要基礎，可激活SREBP-1c的轉錄，進一步促進由SREBP-1c介導的FASN啟動子活化，從而增加FASN的表達。本研究發現，經乙醇作用后肝細胞中磷酸化EGFR(p-EGFR)與SREBP-1c和FASN的基因表達水平同步顯著升高，提示在乙醇所致肝細胞損害中EGFR參與了SREBP-1c對FASN基因轉錄及表達的調控作用；研究同時發現，與乙醇組比較，Gefitinib加乙醇組中p-EGFR的基因表達水平無明顯變化，但p-EGFR的蛋白表達水平有顯著降低，提示轉錄后調節在此可能發揮了重要作用。

原發性肝細胞癌的發生機制尚不明確，目前認為它可能是多因素、多步驟共同作用的結果。現有研究尚無確認酒精為致癌劑的確切證據，酒精在肝癌發生過程中可能主要起輔助因子的作用。本研究中，原代小鼠肝細胞經150 mmol/L乙醇作用10 h，細胞基本形態未出現明顯變化，但其貼壁生長狀況變差，同時細胞裂解液中ALT、AST活性及MDA濃度均出現顯著升高，提示肝細胞損害，而進一步檢測細胞中FASN及SREBP-1c在基因及蛋白水平表達狀況可證實，經乙醇作用后的肝細胞為確保自身生長需要，已充分調動內源性脂肪酸合成能力，此種細胞生物學反應有腫瘤細胞代謝的部分生物化學特性，值得進一步深入研究。

綜上所述，本研究發現，在乙醇所致肝細胞損害中SREBP-1c發揮了對FASN基因過表達的調控作用，而EGFR在此過程可能扮演了重要的角色。但Gefitinib對乙醇所致肝細胞損傷具體的保護作用機制，以及EGFR信號通路在此過程中具體的調控作用機制仍需要深入系統的研究。

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Effects of epidermal growth factor receptor on fatty acid synthase expression in ethanol-induced liver injury

ZHAO Gang, DONG Lei*, LI Hong, SHI Haitao, QIN Bin, ZHAO Hongli, LU Xiaolan

(DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China；*Correspondingauthor,E-mail:dong556@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of fatty acid synthase(FASN) in ethanol-induced liver injury in primary mouse hepatocytes, and to explore the possible role of epidermal growth factor receptor(EGFR) in the process of liver injury.MethodsPrimary mouse hepatocytes were cultured conventionally,and randomly divided into normal control group(saline group), ethanol group, Gefitinib group, and Gefitinib plus ethanol group. Malondialdehyde(MDA) concentrations and activities of alanine aminotransferase(ALT) and aspartate aminotransferase(AST) were detected in cell lysates. Total RNA and protein from liver cells were extracted to measure the mRNA and protein expression of FASN, sterol regulatory element binding proteins(SREBP-1c) and EGFR by real time-PCR and Western blot.ResultsCompared with normal control group, MDA concentrations and activities of ALT and AST increased significantly in ethanol group(P<0.01). Compared with normal control group, FASN, SREBP-1c and p-EGFR expression both in gene and protein levels showed no significant changes in Gefitinib group(P>0.05), but increased in ethanol group(P<0.05 orP<0.01). Compared with ethanol group, the expression of FASN and SREBP-1c was decreased both in gene and protein levels in Gefitinib plus ethanol group(P<0.01), p-EGFR protein expression was also significantly decreased(P<0.05),while p-EGFR mRNA expression was still in the high value, but there was no significant difference(P>0.05).ConclusionFASN slightly expresses in normal liver cells, but highly expresses in ethanol-induced liver injury, which may be regulated by EGFR.

epidermal growth factor receptor；ethanol-induced liver injury；fatty acid synthase；tyrosine kinase inhibitor

陜西省自然科學基金資助項目(2012JQ4030)；西安交通大學第二附屬醫院人才培養專項科研基金資助項目(RC(BL)201301)

趙剛，男，1979-09生，在讀博士，主治醫師

2016-03-16

R575

A

1007-6611(2016)08-0689-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.003