沙格雷酯對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響

韓新源， 陳春燕， 解　翠， 王飛宇， 李秀紅， 田紅燕*

(1陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，西安　710068； 2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院周圍血管科； *通訊作者，E-mail：tianhhyy@126.com)

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沙格雷酯對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響

韓新源1， 陳春燕2， 解翠1， 王飛宇1， 李秀紅1， 田紅燕2*

(1陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，西安710068；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院周圍血管科；*通訊作者，E-mail：tianhhyy@126.com)

目的觀察鹽酸沙格雷酯(5-HT2A受體拮抗劑)對(duì)野百合堿肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和肺動(dòng)脈TGF-β1/Smads信號(hào)分子表達(dá)的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、肺動(dòng)脈高壓模型組(模型組)及沙格雷酯干預(yù)組(沙格雷酯組)。其中模型組和沙格雷酯組采用野百合堿單次腹腔注射法建立肺動(dòng)脈高壓大鼠模型；同時(shí)，沙格雷酯組再給予鹽酸沙格雷酯灌胃。干預(yù)21 d時(shí)分別測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓力(mPAP)，計(jì)算右心肥厚指數(shù)，HE染色觀察肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的變化；采用Mallory三色染色評(píng)估肺動(dòng)脈纖維化程度；Western blot檢測(cè)肺動(dòng)脈轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)及其下游分子磷酸化的Smad3蛋白的表達(dá)水平，以評(píng)估TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的活化。結(jié)果與對(duì)照組相比，干預(yù)21 d時(shí)模型組大鼠的mPAP、右室肥厚指數(shù)明顯升高(P<0.05)；肺組織HE染色結(jié)果顯示，模型組肺動(dòng)脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，纖維組織增生；肺動(dòng)脈中TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，沙格雷酯組mPAP、右室肥厚指數(shù)明顯降低(P<0.05)；管腔狹窄程度也明顯改善，肺動(dòng)脈管壁纖維化程度減低(P<0.01)；肺動(dòng)脈中TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。結(jié)論沙格雷酯抑制野百合堿動(dòng)物模型的肺動(dòng)脈纖維化及改善肺動(dòng)脈高壓程度，這一作用可能是通過抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的活化而實(shí)現(xiàn)的。

沙格雷酯；肺動(dòng)脈高壓；5-羥色胺；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；肺血管重構(gòu)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)進(jìn)展迅速、預(yù)后差，是惡性程度很高的一類肺血管疾病[1]。其病因多、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)，肺動(dòng)脈重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓的主要病理改變之一[2]。肺動(dòng)脈重構(gòu)以血管壁各層包括內(nèi)膜、中膜、外膜不同程度的增厚為特征，導(dǎo)致管腔狹窄、阻力增高。其中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積的增加參與中膜、外膜的增厚[3,4]。研究顯示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)能通過激活其下游Smads蛋白，調(diào)控相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)合成基因的轉(zhuǎn)錄，在心臟、肝臟、肺及腎臟等多種組織器官中參與纖維化的形成[5]。5-羥色胺(serotonin，5-HT)是一種重要的血管活性物質(zhì)，既往的研究結(jié)果顯示5-HT能夠通過與5-HT受體和5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合參與肺動(dòng)脈高壓的形成和發(fā)展[6]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2A受體拮抗劑鹽酸沙格雷酯干預(yù)PAH大鼠，能夠預(yù)防大鼠的肺血管重構(gòu)[7]。然而，在肺動(dòng)脈高壓時(shí)，5-HT是否在肺血管纖維化中發(fā)揮作用及具體的分子機(jī)制，尚不清楚。本研究采用野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠模型，觀察了5-HT2A受體阻滯劑鹽酸沙格雷酯對(duì)PAH時(shí)肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的改善作用，以及對(duì)肺動(dòng)脈TGF-β1/Smads通路表達(dá)的影響，為尋找肺動(dòng)脈高壓新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

野百合堿(美國(guó)Sigma公司)、鹽酸沙格雷酯片(日本三菱制藥株式會(huì)社)、蛋白定量試劑盒(BCA法)(美國(guó)BIO-RAD公司)、TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)、Smad3及p-Smad3兔抗大鼠多克隆抗體(美國(guó)CST公司)。BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，動(dòng)物小型呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)，數(shù)碼攝像顯微鏡(日本Olympus公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDocTM XRS(美國(guó)Bio Rad公司)。

1.2動(dòng)物模型的建立與干預(yù)

雄性清潔級(jí)SD大鼠50只，體重(190±9)g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)，肺動(dòng)脈高壓模型組(模型組，20只)，鹽酸沙格雷酯干預(yù)組(沙格雷酯組，20只)，三組均用標(biāo)準(zhǔn)飼料在同等條件下喂養(yǎng)。對(duì)照組按60 mg/kg腹腔注射生理鹽水，模型組、沙格雷酯組按60 mg/kg腹腔一次性注射野百合堿造模。第2天，沙格雷酯組給予鹽酸沙格雷酯灌胃(150 mg/kg，1次/d)，對(duì)照組、模型組用等體積的生理鹽水灌胃。干預(yù)21 d對(duì)照組大鼠無死亡，模型組死亡10只，沙格雷酯組死亡3只，從沙格雷酯組剩余大鼠中隨機(jī)抽取10只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析。

1.3肺動(dòng)脈壓力及右心指數(shù)測(cè)定

大鼠麻醉后開胸，用藍(lán)色留置針穿入肺動(dòng)脈主干，BL-420生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄mPAP。記錄完畢后處死大鼠，將胸腔剪開，分離右心室(RV)與左心室和室間隔(LV+S)，稱重并計(jì)算右心室肥厚指數(shù)=RV/(LV+S)×100%。

1.4肺組織形態(tài)學(xué)觀察

將4%多聚甲醛中固定的肺組織標(biāo)本脫水、透明、常規(guī)石蠟包埋后切片(5 μm)。將組織切片行HE染色，用顯微鏡觀察動(dòng)脈管壁厚度。采用IPP圖像分析軟件測(cè)量肺小動(dòng)脈管壁厚度，計(jì)算肺動(dòng)脈管壁厚度百分比(WT%)。

組織脫蠟至水同HE染色，組織切片行Mallory染色，光鏡下觀察，膠原纖維為藍(lán)色。采用IPP圖像彩色分析系統(tǒng)對(duì)各組切片中肺動(dòng)脈管壁進(jìn)行圖像分析，測(cè)定血管壁的膠原纖維面積，計(jì)算膠原纖維面積百分比(膠原指數(shù))。

1.5Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解液勻漿、離心后獲得肺小動(dòng)脈總蛋白，BCA試劑盒測(cè)量組織蛋白濃度后，進(jìn)行蛋白變性。SDS-PAGE垂直電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)置PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入一抗，分別為TGF-β1(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 000)、Smad3(1 ∶1 000)、p-Smad3(1 ∶1 000)，4 ℃過夜孵育，洗去抗體后置于二抗中反應(yīng)2 h，經(jīng)TBST充分洗滌后，染色，化學(xué)顯影。用Quantity One成像分析系統(tǒng)進(jìn)行WB條帶的灰度值分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肺動(dòng)脈壓力、右心肥厚指數(shù)的變化

模型組大鼠mPAP較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，提示PAH模型復(fù)制成功；與模型組相比，沙格雷酯組mPAP顯著降低(P<0.05，見圖1A)。與對(duì)照組相比，模型組大鼠右心室肥厚指數(shù)明顯增高(P<0.05)，結(jié)合模型組mPAP升高，進(jìn)一步提示PAH模型復(fù)制成功；與模型組比較，沙格雷酯組明顯降低(P<0.05，見圖1B)。

A.三組大鼠肺動(dòng)脈mPAP比較　　　　　　　　B.三組大鼠肺動(dòng)脈右心肥厚指數(shù)比較與對(duì)照組比較*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖1　三組大鼠的mPAP及右心肥厚指數(shù)比較Figure 1　Comparison of mPAP and right ventricular hypertrophy index among three groups

2.2肺組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色光鏡下可見，對(duì)照組大鼠肺組織肺動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)清楚，厚度正常，外膜未見血管外基質(zhì)沉積(見圖2A)。模型組大鼠肺組織切片肌型肺動(dòng)脈管壁明顯增厚，平滑肌增生肥厚明顯，外膜可見血管外基質(zhì)沉積，管腔狹窄(見圖2B)；沙格雷酯組肺動(dòng)脈管壁無明顯增厚，肺動(dòng)脈外膜周圍可見少量血管外基質(zhì)沉積(見圖2C)。采用IPP圖像分析軟件測(cè)量并計(jì)算肺動(dòng)脈管壁厚度百分比(WT%)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：模型組大鼠肺小動(dòng)脈WT%較對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；沙格雷酯組大鼠肺小動(dòng)脈WT%較模型組明顯降低(P<0.01，見圖3)。

A.對(duì)照組　　　　　　　　　　　　B.模型組　　　　　　　　　　C.沙格雷酯組圖2　三組大鼠肺組織HE染色 (標(biāo)尺=50 μm)Figure 2　Hematoxylin-eosin stain of pulmonary tissues in three groups (bar=50 μm)

與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01圖3　三組大鼠肺動(dòng)脈管壁厚度百分比(WT%)比較Figure 3　Comparison of the percent arterial wall thickness of pulmonary arteries among three groups

2.3肺動(dòng)脈纖維化的觀察

Mallory 三色染色結(jié)果顯示，在對(duì)照組大鼠肺組織內(nèi)可見僅少數(shù)小動(dòng)脈血管壁出現(xiàn)藍(lán)紫色著色組織，系小動(dòng)脈管壁膠原纖維被苯胺藍(lán)所染(見圖4A)；模型組大鼠肺組織內(nèi)有大量藍(lán)紫色著色，提示肺組織內(nèi)大量膠原纖維增生；肺小動(dòng)脈管壁膠原纖維增生明顯(見圖4B)。沙格雷酯組肺動(dòng)脈管壁膠原纖維增生較模型組明顯減少(見圖4C)。對(duì)藍(lán)紫色著色的膠原纖維面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果示模型組大鼠肺血管周圍膠原面積百分比較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；沙格雷酯組大鼠肺血管周圍膠原面積百分比較模型組則明顯下降(P<0.01，見圖5)。

A.對(duì)照組　　　　　　　　　　B.模型組　　　　　　　　C.沙格雷酯組圖4　大鼠肺動(dòng)脈Mallory染色圖 (標(biāo)尺=50 μm)Figure 4　Mallory trichrome staining of pulmonary arteries in the three groups (bar=50 μm)

與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01 圖5　三組大鼠肺動(dòng)脈膠原面積百分比的比較Figure 5　Comparison of the pulmonary arterial collagen area among three groups

2.4肺動(dòng)脈中TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)

經(jīng)Western blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PAH大鼠肺動(dòng)脈TGF-β1和p-Smad3的表達(dá)明顯增加(P<0.01vs對(duì)照組)；而用鹽酸沙格雷酯干預(yù)部分阻斷5-HT的作用后，則能夠降低肺動(dòng)脈TGF-β1和p-Smad3的蛋白表達(dá)(圖6)。

3　討論

盡管有關(guān)PAH的確切發(fā)生機(jī)制目前仍然不明，但是廣泛認(rèn)可的所有類型PAH的共同標(biāo)志為肺血管的收縮和重構(gòu)。肺血管重構(gòu)以血管壁各層包括內(nèi)膜、中膜、外膜不同程度的增厚以及前毛細(xì)血管動(dòng)脈的細(xì)胞表達(dá)平滑肌特異性的標(biāo)志物為特征。其中，中膜的增厚是由于平滑肌細(xì)胞的肥大、聚集增加以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積增加，主要是膠原蛋白和彈性蛋白。外膜增厚則是由成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的聚集和細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、固生蛋白)沉積明顯增加造成的[3,4]。血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的生成增多導(dǎo)致管壁纖維化，從而使得血管壁的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯的改變。本研究發(fā)現(xiàn)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠mPAP和右心室肥厚指數(shù)明顯增加，說明PAH模型構(gòu)建成功，進(jìn)一步的病理染色結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，此外，血管壁纖維組織明顯增加。提示PAH大鼠血管壁纖維化參與肺動(dòng)脈高壓的過程。

與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01圖6　大鼠肺動(dòng)脈TGF-β1/Smad3通路激活情況Figure 6　The expression of TGF-β1/Smad3 signal pathway in pulmonary artery in the three groups

TGF-β1是具有多種功能的細(xì)胞因子，參與體內(nèi)多種病理和生理過程，對(duì)血管發(fā)育和血壓穩(wěn)態(tài)維持起到重要作用。既往研究結(jié)果顯示，阻斷TGF-β1的表達(dá)，細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)也明顯受到抑制，提示TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，在血管重構(gòu)過程中起著關(guān)鍵作用[8]。本研究觀察到，在PAH大鼠肺動(dòng)脈中的TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，初步證實(shí)TGF-β1誘導(dǎo)的信號(hào)通路參與PAH大鼠肺動(dòng)脈的纖維化過程。Smads蛋白是TGF-β1下游的重要信號(hào)分子，Smad3是Smads信號(hào)蛋白家族中的關(guān)鍵蛋白，在TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有核心地位[9]。研究顯示，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的過度激活，是導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)肝臟和心臟等組織發(fā)生進(jìn)行性增殖和纖維化病變的關(guān)鍵所在[10,11]。

本研究結(jié)果進(jìn)一步觀察到PAH大鼠肺動(dòng)脈的Smad3磷酸化水平顯著增高，進(jìn)一步證實(shí)在PAH大鼠肺動(dòng)脈中TGF-β1/Smad3信號(hào)通路呈顯著活化狀態(tài)。

5-HT是機(jī)體內(nèi)一類重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，5-HT在肺血管重構(gòu)中起重要作用。5-HT發(fā)揮調(diào)節(jié)作用主要是通過與相應(yīng)的受體結(jié)合，已有證據(jù)證實(shí)5-HT1B、5-HT2A、5-HT2B受體與PAH肺動(dòng)脈重構(gòu)相關(guān)[12]。本課題組前期的研究已經(jīng)證明，5-HT可以通過5-HT2A受體促進(jìn)肺動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞增殖、抑制凋亡，參與肺動(dòng)脈重構(gòu)[7]。本研究進(jìn)一步表明5-HT2A受體拮抗劑鹽酸沙格雷酯干預(yù)能夠預(yù)防MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺動(dòng)脈壓力增高、右室肥厚和肺動(dòng)脈管壁增厚，而且使肺動(dòng)脈管壁膠原生成減少，同時(shí)對(duì)其可能的分子生物學(xué)機(jī)制做了初步探討，結(jié)果顯示，5-HT2A受體拮抗劑鹽酸沙格雷酯能夠顯著抑制肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈TGF-β1及其下游p-Smad3的產(chǎn)生，這可能是5-HT2A受體阻斷劑抗PAH的機(jī)制之一。繼往已有研究結(jié)果顯示，在腎小球系膜細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞中，5-HT能促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)從而發(fā)揮促纖維化的作用[13，14]。

總之，在PAH的發(fā)生發(fā)展過程中，肺動(dòng)脈纖維化在肺動(dòng)脈重構(gòu)中也扮演著重要的角色。本研究結(jié)果表明，5-HT2A受體阻滯劑鹽酸沙格雷酯能夠降低肺動(dòng)脈壓力，減輕肺動(dòng)脈纖維化、改善肺動(dòng)脈重構(gòu)，并觀察到TGF-β1/Smads信號(hào)通路可能是其作用的分子機(jī)制之一。研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充完善PAH的發(fā)病機(jī)制，并為鹽酸沙格雷酯在PAH治療中的應(yīng)用提供初步的理論基礎(chǔ)。

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Effects of sarpogrelate on the TGF-β1/Smads signal pathway in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension rats

HAN Xinyuan1, CHEN Chunyan2, XIE Cui1, WANG Feiyu1, LI Xiuhong1, TIAN Hongyan2*

(1DepartmentofCardiology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:tianhhyy@126.com)

ObjectiveTo explore the effects of sarpogrelate(5-HT2Areceptor antagonist) on the structure of pulmonary artery and the TGF-β1/Smads signal pathway in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension(PAH) rats.MethodsThe rats were divided into control group，model group and sarpogrelate group. The rats were intraperitoneally injected with monocrotaline(MCT) once to induce the pulmonary artery hypertension in model group on and sarpogrelate group，and then the rats were additionally given sarpogrelate by gavage in sarpogrelate group. On the 21st day after treatment, the mean pulmonary arterial pressure(mPAP) was measured and the right ventricular hypertrophy index was calculated. HE staining method was used to observe the morphologic changes of peripheral pulmonary artery. Mallory trichrome staining was used to evaluate the extent of pulmonary arterial wall fibrosis. Western blot was used to detect the TGF-β1 and p-Smad3 protein expression in pulmonary arteries.ResultsCompared with control group, the mPAP and right ventricular hypertrophy index were increased in model group on the 21st day after treatment(P<0.05), the pulmonary arterial wall became thick and the deposition of collagen drastically increased, and the protein levels of TGF-β1 and p-Smad3 were elevated(P<0.01). Compared with model group, the mPAP and RV hypertrophy decreased in sarpogrelate group(P<0.05), the PA wall became thin and the fibrosis of pulmonary arterial wall was decreased(P<0.01). The protein levels of TGF-β1and p-Smad3 in PA were significantly lower in sarpogrelate group than in model group(P<0.01).ConclusionSarpogrelate can improve the fibrosis and pulmonary arterial hypertension in PAH rats and TGF-β1/Smads signal pathway may be involved in this process．

sarpogrelate;pulmonary artery hypertension;serotonin;transforming growth factor;pulmonary ventricular remodeling

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170294)

韓新源，男，1980-04生，博士，主治醫(yī)師，E-mail：hanxinyuan0408@163.com

2016-06-03

R543.2

A

1007-6611(2016)08-0706-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.007