染料木素對哮喘小鼠氣道炎癥及肺組織蛋白酪氨酸激酶JAK1表達(dá)的影響

李　惠， 盧洪梅， 鄒立華， 陳小丹

(1深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，深圳　518172； 2廣東醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院)

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染料木素對哮喘小鼠氣道炎癥及肺組織蛋白酪氨酸激酶JAK1表達(dá)的影響

李惠1， 盧洪梅2， 鄒立華1， 陳小丹1

(1深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，深圳518172；2廣東醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院)

目的探討槐角染料木素對小鼠氣道炎癥及肺組織蛋白酪氨酸激酶Janus激酶1(Janus kinase 1，JAK1)的影響。方法32只雌性BALB/c小鼠隨機分為對照組(n=10)、哮喘模型組(n=11)和染料木素干預(yù)組(n=11)。模型組和干預(yù)組采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)，建立哮喘小鼠模型。對照組于相同時間采用等量生理鹽水代替OVA。干預(yù)組于霧化吸入前30 min給予染料木素30 mg/kg腹腔注射。用免疫印跡法觀察小鼠肺組織中JAK1的表達(dá)。制作肺組織病理切片，HE染色后光鏡下觀察小鼠氣道炎癥的病理學(xué)變化。結(jié)果模型組小鼠肺組織中JAK1的表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.01)；干預(yù)組小鼠肺組織中JAK1的表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.01)。模型組和干預(yù)組小鼠肺組織炎癥病理學(xué)評分分別是(9.697±1.768)分和(5.000±2.620)分，均明顯高于對照組(0.198±0.170)分(均P<0.01)；干預(yù)組小鼠肺組織炎癥病理學(xué)評分明顯低于模型組(P<0.01)。病理切片觀察結(jié)果示，對照組支氣管及血管周圍無炎性細(xì)胞浸潤；干預(yù)組小鼠支氣管和血管周圍有少量淋巴細(xì)胞伴隨中性粒細(xì)胞浸潤；模型組支氣管和血管周圍有大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，部分小鼠支氣管上皮脫落，少量出現(xiàn)嚴(yán)重的黏液分泌。結(jié)論染料木素可下調(diào)哮喘小鼠蛋白酪氨酸激酶JAK1的表達(dá)，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)，可能是其緩解哮喘的作用機制。

哮喘；小鼠；染料木素；蛋白酪氨酸激酶；Janus激酶1

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種全球性多發(fā)病、常見病，細(xì)胞因子功能紊亂是哮喘發(fā)病的重要基礎(chǔ)，細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄活化因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)信號傳導(dǎo)途徑在哮喘的發(fā)病中也起重要作用[1]。染料木素(genistein)為特異性蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)抑制劑，在生物體內(nèi)具有抗腫瘤、抗氧化、拮抗雌激素等生物學(xué)活性[2,3]。目前染料木素對呼吸系統(tǒng)疾病影響方面的研究主要集中在肺癌、肺纖維化及肺動脈高壓防治方面，而對哮喘防治方面的研究相關(guān)較少[4,5]。本研究旨在觀察槐角染料木素對小鼠氣道炎癥及肺組織蛋白酪氨酸激酶JAK1的影響，初步分析染料木素緩解哮喘的作用機制，為染料木素治療哮喘提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

染料木素(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，卵清清蛋白OVA(美國sigma公司)，TO型生物制片透明劑(廣州市中南化工儀器有限公司)，蘇木素染液(南昌雨露實驗器材有限公司)，伊紅染液(南昌雨露實驗器材有限公司)，電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.2實驗動物及飼養(yǎng)

6-8周雌性BALB/c小鼠32只，SPF級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，質(zhì)量合格證編號：No.44007200022603。按照廣東省動物實驗監(jiān)測所相關(guān)操作規(guī)程，小鼠飼養(yǎng)于屏障動物實驗室，實驗動物使用許可證編號：SYXK(粵)2012-0122。IACUC審批編號：2015015。動物室溫度20-26 ℃，相對濕度40%-70%。SPF級鼠飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飲用消毒純水。

1.3實驗分組與動物致敏

32只小鼠隨機分為以下3組：對照組(10只)，哮喘模型組(模型組，11只)及染料木素給藥干預(yù)組(干預(yù)組，11只)。

模型組和干預(yù)組分別于第1，15天兩次致敏，每次每只小鼠腹腔注射0.2 ml OVA溶液(OVA 10 mg加生理鹽水10 ml，氫氧化鋁40 mg加生理鹽水10 ml，兩者等體積混勻，0.22 μm濾器過濾)。對照組每只小鼠于相同時間腹腔注射等量生理鹽水。

1.4動物激發(fā)及肺組織取材

模型組和干預(yù)組小鼠于實驗第22天，每日霧化吸入含5%OVA的生理鹽水溶液以激發(fā)，每次30 min，連續(xù)14 d。干預(yù)組小鼠并于每次霧化前30 min腹腔內(nèi)注射染料木素30 mg/kg。對照組小鼠于相同時間霧化吸入等量生理鹽水，余同模型組。小鼠摘取眼球取血法處死后，取右肺上葉組織進行病理學(xué)觀察，取左肺組織進行JAK1表達(dá)分析。

1.5小鼠肺組織病理學(xué)觀察

小鼠肺組織取材后常規(guī)固定，石蠟包埋，制成4 μm厚的切片，HE染色，封片后光鏡下觀察小鼠肺組織炎癥病理學(xué)改變。參考1995年S.Underwood采用的病理評分標(biāo)準(zhǔn)[6]，分別對支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤、血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤、支氣管上皮損傷及黏液分泌四項進行評分，每1項0-5分，分值越高表示炎癥越重。每張切片隨機選取3個視野(10×40)，分別計算每個視野下上述4項評分之和，3個視野的平均值即該小鼠肺病理評分。

1.6免疫印跡法檢測蛋白酪氨酸激酶JAK1的表達(dá)

1.6.1蛋白定量取出小鼠肺組織，研磨后轉(zhuǎn)移至離心管，加入細(xì)胞裂解液和蛋白水解酶抑制劑。12 000 r/min 4 ℃離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，-20 ℃保存。從-20 ℃取出5 mg/ml BSA，室溫融化后，備用，使用前需稀釋成1 mg/ml BSA。使用96孔板，分別加入1 mg/ml BSA 0,1,2,4,6,8,10 μl，用蒸餾水補足各管至20 μl。樣品取10 μl稀釋10倍，相同樣品做3個副孔，每孔加樣20 μl。各孔各加G-250(考馬斯亮藍(lán))溶液200 μl混勻，室溫靜止2 min。混勻后，在生物分光光度計上比色分析，測定595 nm的光吸收，測定各孔吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本濃度。根據(jù)上樣量構(gòu)建上樣體系后將樣品置于干式恒溫金屬中加熱98 ℃10 min使蛋白變性。放于-20 ℃保存。

1.6.2SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜清洗玻璃板后對齊、卡緊、驗漏。灌入分離膠→棄去異丙醇→清洗→吸干→灌入濃縮膠→放入電泳槽→上樣。電泳：電壓60V，時間約3-4 h，電泳至溴酚蘭剛跑出即終止，轉(zhuǎn)膜。

1.6.3免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用TBST在室溫下?lián)u床上洗3次，每次5 min。將膜后移至含有封閉液的容器中，室溫下?lián)u床上搖動封閉2 h。從封閉液中將膜取出，室溫下TBST漂洗3次，每次10 min。將膜蛋白面朝上放于槽中，加入一抗，搖床上4 ℃過夜，次日室溫孵育30 min后室溫TBST漂洗3次，每次10 min。將膜蛋白面朝上放于槽中，加入二抗，搖床上室溫孵育1 h后，將膜放入TBST漂洗3次，每次10 min。

1.6.4化學(xué)發(fā)光、顯影、定影及凝膠圖像分析將發(fā)光A,B液等體積混合置于小盒中,將PVDF膜浸潤發(fā)光液，打開X線片夾，鋪上保鮮膜，將PVDF膜面朝上放于保鮮膜后用保鮮膜包好。把X線片放在膜上，調(diào)整曝光時間。曝光完成后，取出X線片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影結(jié)束后，洗片、定影。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1小鼠肺組織中的JAK1表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中JAK1表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.01)；干預(yù)組小鼠肺組織中JAK1表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.01，見圖1)

2.2小鼠肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果

模型組和干預(yù)組小鼠肺組織炎癥病理學(xué)評分分別是(9.697±1.768)分和(5.000±2.620)分，均明顯高于對照組的(0.198±0.170)分(均P<0.01)，干預(yù)組小鼠肺組織炎癥病理學(xué)評分明顯低于模型組(P<0.01)。病理切片觀察結(jié)果示，對照組支氣管結(jié)構(gòu)正常，支氣管及血管周圍無炎性細(xì)胞浸潤(見圖2A)；干預(yù)組小鼠支氣管和血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主伴隨少量的中性粒細(xì)胞，支氣

管上皮完整，未發(fā)現(xiàn)有黏液分泌(見圖2B)；模型組支氣管和血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主以及大量的中性粒細(xì)胞，此外部分小鼠支氣管上皮脫落，少量出現(xiàn)嚴(yán)重的黏液分泌(見圖2C)。

圖1　免疫印跡法示小鼠肺組織中的JAK1表達(dá)Figure 1　Western blot analysis of JAK1 expression in lung tissues of mice

A.對照組　　　　　　　　　　　B.干預(yù)組　　　　　　　　　 　C.模型組圖2　小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) (HE染色，×400)Figure 2　Pathological changes of lung tissues (HE staining,×400)

3　討論

哮喘是以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞為主的多種炎性細(xì)胞介導(dǎo)的氣道慢性非特異性炎性疾病[7]。本研究中，模型組和干預(yù)組小鼠病理學(xué)評分明顯高于對照組，干預(yù)組小鼠病理學(xué)評分明顯低于模型組。病理切片觀察結(jié)果示，對照組支氣管結(jié)構(gòu)正常，支氣管及血管周圍無炎性細(xì)胞浸潤；干預(yù)組小鼠支氣管和血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主伴隨少量的中性粒細(xì)胞，支氣管上皮完整，未發(fā)現(xiàn)有黏液分泌；模型組支氣管和血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主以及大量的中性粒細(xì)胞，此外部分小鼠支氣管上皮脫落，少量出現(xiàn)嚴(yán)重的黏液分泌。

細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的JAK/STAT6信號傳導(dǎo)途徑廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等過程,是多種細(xì)胞因子和生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑[8]。大量研究表明,JAK/STAT傳導(dǎo)通路的異常與過敏性疾病的發(fā)病密切相關(guān)，該途徑是目前過敏性疾病研究領(lǐng)域的熱點之一[9]。

蛋白酪氨酸激酶在炎癥細(xì)胞和氣道固有細(xì)胞的激活和增殖中起重要作用,其信號級聯(lián)幾乎貫穿于哮喘發(fā)病的每一個過程。蛋白酪氨酸激酶分為受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinases,RTK)和非受體酪氨酸激酶(non-receptor protein tyrosine kinases,nrPTK)兩大類，前者在氣道重塑發(fā)病機制中十分重要,后者活化后是炎癥細(xì)胞對變應(yīng)原誘導(dǎo)的免疫受體激活的早期信號肽[10]。JAK是一種nrPTK，該家族包括JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶(TYK)2。細(xì)胞因子可經(jīng)多種途徑進行細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡過程。細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后引起受體的構(gòu)象改變,從而激活了與受體關(guān)聯(lián)的JAK激酶家族(JAK-1、JAK-2、JAK-3和TYK-2)，JAK激酶促使相應(yīng)的STAT磷酸化而使其激活，活化的STAT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與GAS增強子家族成員結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄、誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、調(diào)控細(xì)胞增殖和存活相關(guān)基因的表達(dá)。如：活化的IL-4受體激活JAK-1和JAK-3，進而活化STAT-6，活化的IL-13受體激活JAK-1和JAK-2，進而激活STAT-6[11-13]。

槐角又稱槐實，為豆科植物槐(SophorajaponicaL)的果實。槐角含有多種化學(xué)成分，主要為黃酮類化合物，還有三砧皂昔、生物堿、磷脂、氨基酸以及多糖等，槐角染料木素是從槐角中分到的異黃酮，也稱染料木黃酮、金雀異黃酮。在食物中增加染料木素可以減輕哮喘患者的癥狀，提高FEV1，改善患者肺功能，減少哮喘控制不良事件的發(fā)生[14]。研究發(fā)現(xiàn)染料木素可抑制ERK1/2的磷酸化，抑制肥大細(xì)胞的活化，減輕過敏性炎癥反應(yīng)，可能與其阻斷ERK信號通路有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中的JAK1表達(dá)水平明顯高于對照組，干預(yù)組小鼠肺組織中的JAK1表達(dá)水平明顯低于模型組，表明JAK1的高表達(dá)與哮喘發(fā)病有關(guān)，染料木素可下調(diào)哮喘小鼠蛋白酪氨酸激酶JAK1的表達(dá)，推測染料木素可阻斷JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路，減輕哮喘的炎癥反應(yīng)，緩解哮喘癥狀。

綜上所述，染料木素可下調(diào)哮喘小鼠蛋白酪氨酸激酶JAK1的表達(dá)，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng),表明槐角染料木素有潛在的緩解哮喘的應(yīng)用價值，有望成為新的治療哮喘的藥物。

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Effect of genistein on the expression of protein tyrosine kinase JAK1 in mice with asthma

LI Hui1, LU Hongmei2, ZOU Lihua1, CHEN Xiaodan1

(1LonggangPeople’sHospitalofShenzhen,Shenzhen518172,China;2SecondClinicalMedicalSchool,GuangdongMedicalCollege)

ObjectiveTo explore the effect of genistein of fructus sophorae on airway inflammation and the expression of protein tyrosine kinase Janus kinase 1(kinase Janus 1,JAK1) in mice with asthma.MethodsThirty-two BALB/c female mice were randomly divided into control group(n=10), asthma model group(n=11) and genistein group(n=11).The mice in model group and genistein group were sensitized and excited with ovalbumin(OVA) to establish the model of asthma, while the mice in control group were given the same amount of normal saline instead of OVA at the same time．The mice in genistein group were intraperitoneally injected with 30 mg/kg genistein 30 min before atomization inhalation. The expression of JAK1 in lung tissues was detected by Western blot. The pathological changes of airway inflammation in mice were observed under light microscope by HE staining.ResultsThe expression of JAK1 in lung tissues were significantly higher in model group than in control group(P<0.01). The expression of JAK1 in lung tissues was significantly lower in genistein group than in model group(P<0.01). In model group and genistein group, the pathological scores were (9.697±1.768)and (5.000±2.620)respectively, and both were significantly higher than in control group(0.198±0.170)(P<0.01). In control group, there was no inflammatory cell infiltration around the bronchus and blood vessels. In genistein group, there were a small amount of lymphocytes accompanied with neutrophils infiltration around the bronchus and blood vessels. In model group, there were a large number of lymphocytes with neutrophils infiltration around the bronchus and blood vessel, and the bronchial epitheliums of some mice were shed, and there were a small amount of severe mucus secretion.ConclusionGenistein can down regulate the expression of protein tyrosine kinase JAK1, and alleviate the airway inflammation in mice with asthma.

asthma;mouse；genistein；protein tyrosine kinases；Janus kinase 1

深圳市科技研發(fā)資金知識創(chuàng)新計劃基金資助項目(JCYJ20140414123607244)；深圳市龍崗區(qū)科技計劃扶持基金資助項目(PT2015092)

李惠，女，1979-10生，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail: 280483807@qq.com

2016-06-03

R562.25

A

1007-6611(2016)08-0711-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.008