雙歧桿菌對母嬰分離大鼠成年后腸道敏感性及結腸腦源性神經營養因子表達的影響

許紹嫻， 秦　斌， 董　蕾*， 張濤紅， 王　華， 楊素貞

(1西安交通大學第二附屬醫院消化內科，西安　710004； 2西安交通大學第一附屬醫院婦產科； *通訊作者，E-mail:dong556@126.com)

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雙歧桿菌對母嬰分離大鼠成年后腸道敏感性及結腸腦源性神經營養因子表達的影響

許紹嫻1， 秦斌1， 董蕾1*， 張濤紅2， 王華1， 楊素貞1

(1西安交通大學第二附屬醫院消化內科，西安710004；2西安交通大學第一附屬醫院婦產科；*通訊作者，E-mail:dong556@126.com)

目的研究雙歧桿菌干預對母嬰分離大鼠成年后內臟敏感性與腦源性神經營養因子(BDNF)表達的影響。方法新生期SD大鼠隨機分成正常組(NS)、模型組(MS)、雙歧桿菌組(MS+Bif)和溶劑對照組(MS+vehicle)，通過新生期母嬰分離建立大鼠腸道高敏感性模型。新生鼠斷奶后雙歧桿菌組及溶劑對照組給予灌胃干預。至大鼠成年(8周齡)時通過階梯體積(0,0.4,0.8,1.2 ml)直腸球囊擴張評價四組大鼠內臟敏感性。蛋白質印跡法檢測大鼠結腸BDNF的表達，免疫組織化學檢測肥大細胞及類胰蛋白酶表達。結果與正常組比較，模型組VMR值在0.8 ml、1.2 ml顯著升高(P<0.01)，BDNF表達顯著升高(P<0.01),肥大細胞計數及類胰蛋白酶表達均顯著升高(P<0.01)。與模型組和溶劑對照組比較，雙歧桿菌組VMR值在0.8 ml、1.2 ml顯著降低(P<0.01或P<0.05)，BDNF表達顯著降低(P<0.05),肥大細胞計數及類胰蛋白酶均顯著降低(P<0.01)。結論BDNF參與母嬰分離模型大鼠內臟高敏感性的發生，雙歧桿菌干預可降低大鼠成年后BDNF表達而改善內臟高敏感性。

腦源性神經營養因子(BDNF)；內臟高敏感性；雙歧桿菌；母嬰分離

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種常見的功能性胃腸病，表現為消化道感覺和動力異常，以慢性反復發作的腹痛或腹部不適伴有排便習慣改變，而無器質性病變及生物學異常證據為特征。內臟高敏感(visceral hypersensitivity, VH)是IBS的一個重要特征。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一種內源性神經營養因子，不僅與神經的生長發育相關，還與軀體/內臟疼痛及高敏感性的發生密切相關[1,2]。研究發現很多IBS患者存在有腸道菌群失調，益生菌能夠調節腸道菌群失調，并顯著改善IBS和炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)患者相關癥狀[3]。動物實驗中也可發現腸道微生物環境的改變，早期應用益生菌可改善IBS大鼠腸道敏感性[4,5]，其機制可能與改變大鼠結腸調節疼痛和炎癥基因的表達有關[6]。本研究通過早期雙歧桿菌干預母嬰分離大鼠腸易激模型，觀察大鼠內臟敏感性及BDNF的變化，為進一步研究IBS的病理生理機制及治療提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物

初產的健康SPF級Sprague-Dawley大鼠孕鼠6只，受孕13-14 d，由西安交通大學醫學部動物實驗中心提供，飼養于西安交通大學醫學部動物實驗中心，每只孕鼠單獨飼養，自由飲食飲水，飼養室溫度為20-25 ℃，濕度為(50±5)%，光照周期為12 h∶12 h。實驗動物生產許可證號：SCXK(陜)08-018。動物實驗符合西安交通大學醫學部動物實驗中心管理委員會有關動物管理和使用規定。

1.2主要試劑

兔抗大鼠BDNF, GAPDH抗體(沈陽萬類生物有限公司)；小鼠抗大鼠MCT抗體(英國Abcam)；雙歧桿菌(自金雙歧片中分離, 內蒙古雙岐藥業)；蛋白提取試劑盒、上樣緩沖液(西安赫特生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Tris-Base, SDS, 甘氨酸(美國Sigma-Aldrich)。1.3大鼠母嬰分離

采用母嬰分離建立大鼠腸易激綜合癥內臟高敏感模型[7]，新生SD大鼠從出生后第2-12天，每天早上9：00-12:00將幼鼠從母鼠籠中取出分離3 h，單獨置于大鼠飼養籠中，控制溫度在30-33 ℃，第13天開始與母鼠共同飼養，正常組幼鼠出生后與母鼠共同飼養，不做分離處理。所有實驗幼鼠至第23天斷奶，第30天雌雄分籠飼養。

1.4動物分組與干預

新生期SD大鼠隨機分成正常組(NS)、模型組(MS)、雙歧桿菌組(MS+Bif)和溶劑組(MS+Vehicle)。新生鼠斷奶后，雙歧桿菌組每天給予雙歧桿菌灌胃(107CFU/ml，劑量參照文獻[8]中所述)，溶劑組給予相應體積溶劑作為對照。至大鼠成年(8周齡)時測定四組大鼠內臟敏感性。

1.5內臟敏感性檢測

根據文獻[9]中描述方法，采用Power Lab電生理記錄分析儀和生物電放大器記錄在階梯體積球囊擴張下大鼠腹外斜肌的放電活動(VMR)，VMR記錄結果使用Chart5.0軟件進行測量計算，采用擴張過程中20 s的曲線下面積(AUC)減去擴張前基線期20 s的面積。將正常組大鼠0.4 ml擴張時AUC設為參照AUC(control)。VMR相對值為[擴張中20 s的AUC-擴張前基線期20 s內AUC]/參照AUC。內臟敏感性檢測結束后，水合氯醛麻醉處死動物，腹主動脈取血并留取結腸標本于-80 ℃保存。

1.6Western blot 檢測結腸BDNF表達

大鼠結腸組織按照每100 mg組織加入1 000 μl RIPA裂解液提取總蛋白，應用SDS-PAGE凝膠電泳檢測結腸BDNF表達，通過Gel-Pro軟件分析，與內參的灰度比值作為其相對表達水平。

1.7免疫組化檢測結腸MCT表達

沿著腸道縱軸連續切片，每組隨機選取切片，進行免疫組織化學染色：脫蠟，水化，抗原修復，一抗4 ℃孵育過夜，孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水封片。鏡下觀察，每組取5個視野下免疫陽性細胞數進行統計，通過image plus pro軟件計算積分光密度值，作為目的蛋白表達水平。

1.8統計學分析

2　結果

2.1雙歧桿菌對母嬰分離大鼠內臟敏感性的影響

與正常組相比，模型組在0,0.4 ml體積球囊擴張時VMR無明顯差異(P>0.05)，在0.8 ml,1.2 ml時VMR顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，雙歧桿菌組在0.8 ml,1.2 ml時VMR顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，溶劑對照組在0, 0.4, 0.8和1.2 ml時VMR均無明顯差異(P>0.05)；與溶劑對照組相比，雙歧桿菌組在0.8 ml和1.2 ml時VMR顯著降低(P<0.05,見圖1)。

2.2雙歧桿菌對母嬰分離大鼠結腸BDNF表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織BDNF水平顯著升高(P<0.01)。雙歧桿菌組大鼠結腸組織BDNF表達水平與模型組比較顯著降低(P<0.05)，并與溶劑對照組存在顯著性差異(P<0.05，見圖2)。

NS：正常組；MS：模型組；MS+Bif：雙歧桿菌組；MS+vehicle：溶劑對照組；與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.01；與溶劑對照組比較，△P<0.01圖1　雙歧桿菌對母嬰分離大鼠內臟敏感性的影響Figure 1　Effect of bifidobacterium on visceromotor response in maternal-separated rats

NS：正常組；MS：模型組；MS+Bif：雙歧桿菌組；MS+vehicle：溶劑對照組；與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與溶劑對照組比較，#P<0.05圖2　雙歧桿菌對母嬰分離大鼠結腸BDNF表達的影響Figure 2　Effect of bifidobacterium on expression of BDNF in maternal separated rats

2.3雙歧桿菌對母嬰分離大鼠結腸肥大細胞計數及類胰蛋白酶表達的影響

與正常組比較，模型組肥大細胞數目及類胰蛋白酶表達均顯著升高(P<0.01)；雙歧桿菌組肥大細胞數目及類胰蛋白酶表達與模型組比較均顯著降低(P<0.01)，與溶劑對照組存在顯著差異(P<0.01，見圖3，4)。

圖3　雙歧桿菌對母嬰分離大鼠結腸類胰蛋白酶表達的影響 (免疫組化染色，×200)Figure 3　Effect of bifidobacterium on expression of MCT in maternal separated rats (IH，×200)

NS：正常組；MS：模型組；MS+Bif：雙歧桿菌組；MS+vehicle：溶劑對照組；與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，ΔP<0.01；與溶劑對照組比較，#P<0.01圖4　雙歧桿菌對母嬰分離大鼠結腸肥大細胞計數及類胰蛋白酶表達的影響Figure 4　Effect of bifidobacterium on mast cells number and expression of MCT in maternal-separated rats

3　討論

腸易激綜合征發病機制尚不明確，目前普遍認為與內臟敏感性增加、腸道免疫失調、腸道微生態改變、心理應激、腸道微小炎癥、腸黏膜通透性改變、神經內分泌因子異常等病理生理改變有關。內臟敏感性的增高認為是腸易激綜合征的主要病理生理機制之一，即內臟對刺激的反應性增高，引起腹痛或腹部不適的癥狀。

內臟敏感性由神經、體液因子共同調控。腸神經系統(enteric nervous system，ENS)由胃腸道壁內神經成分組成，合成并釋放多種神經因子，參與調節胃腸道感覺及運動功能。體液因子5-HT、NO、CRH等均參與內臟高敏感性的形成。BDNF是一種內源性神經營養因子，BDNF不僅與腸神經的生長發育相關，還參與內臟的運動及痛覺感知功能，同時參與焦慮抑郁情緒的調節。炎癥等刺激引起BDNF釋放增加，其作用于ENS，促進興奮性神經遞質釋放，也可通過與NGF、CGRP等神經因子相互作用，導致內臟高敏感性的形成。動物實驗證實，慢性避水應激可使大鼠結腸BDNF表達增加，致其內臟高敏感性形成[10]。本研究通過母嬰分離建立IBS動物模型，證實母嬰分離大鼠成年后表現為內臟高敏感，同時，與正常對照組比較，模型大鼠結腸組織BDNF水平升高，提示母嬰分離大鼠成年后異常表達的BDNF參與其內臟高敏感的形成。

肥大細胞是一種免疫細胞，主要分布于結腸黏膜及黏膜下層，貯存和分泌多種生物活性介質，如類胰蛋白酶、組胺等，這些產物通過調節腸黏膜局部免疫和通透性參與IBS的發生。研究發現類胰蛋白酶在IBS結腸黏膜含量增多，而類胰蛋白酶主要合成于肥大細胞，活化釋放后可以作用于腸道神經元上蛋白激活酶受體PAR-2，參與調節腸道運動、感覺及黏膜通透性等生理過程[11,12]。另一研究表明，肥大細胞活化促進小膠質細胞表達BDNF，而P2X4R表達于小膠質細胞，這一效應依賴于肥大細胞活化產物類胰蛋白酶作用于該受體[13]。本研究通過早期生活應激事件(母嬰分離)建立大鼠內臟高敏感模型，發現模型大鼠肥大細胞數量及類胰蛋白酶表達增多，提示肥大細胞活化及其活化產物參與內臟高敏感性形成。

腸道菌群失調可能是IBS發病的一個危險因素。研究發現，應激可導致腸道菌群失調[8]，微生態制劑的單獨使用或者聯合其他藥物可以改善腸道菌群紊亂狀態，改善腹痛、腹脹等腹部癥狀及大便不成形，對部分IBS患者有效。微生態制劑的作用機制可能是通過建立正常菌群、抑制肥大細胞脫顆粒及炎癥反應、調節腸道通透性增強腸黏膜屏障等。本研究結果表明，早期給予雙歧桿菌干預可降低BDNF及類胰蛋白酶表達，改善IBS大鼠內臟高敏感性。雙歧桿菌的這種作用可能是通過抑制肥大細胞活化，減少類胰蛋白酶作用于P2X4R，從而減少小膠質細胞表達BDNF。

綜上所述,新生期母嬰分離大鼠成年后表現為內臟高敏感，同時結腸組織BDNF表達水平增高，早期給予雙歧桿菌干預可逆轉這一改變，并改善IBS大鼠成年后內臟高敏感性，通過肥大細胞抑制小膠質細胞BDNF表達是其可能的作用機制之一。

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Effect of bifidobacterium on maternal separation-induced visceral hypersensitivity and brain-derived neurotrophic factor expression in adult rats

XU Shaoxian1, QIN Bin1, DONG Lei1*, ZHANG Taohong2, WANG Hua1, YANG Suzhen1

(1DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:dong556@126.com)

ObjectiveTo investigate the effects of bifidobacterium on brain-derived neurotrophic factor(BDNF) expression and visceral hypersensitivity in maternal-separated rats.MethodsNeonatal rats were divided into four groups: maternal separation group(model group), normal group, bifidobacterium group(MS+Bif) and vehicle control group(MS+vehicle). Maternal separation was used to establish visceral hypersensitivity in rats. After weaning, rats received bifidobacterium or vehicle daily in bifidobacterium group(MS+Bif) and vehicle control group(MS+vehicle). At 8 week, visceral sensitivity was measured as the visceromotor response(VMR) to colorectal distension(CRD) caused by balloon dilation by a graded volume of water(0,0.4,0.8,1.2 ml). Western blot was performed to investigate the expression of BDNF. Immunohistochemistry was used to investigate the number of MCT positive mast cells and level of tryptase.ResultsCompared with normal group, both VMR were significantly increased at 0.8 ml, 1.2 ml in model group(P<0.01), and the MCT positive mast cells, BDNF protein expression and tryptase levels were also increased(P<0.01). Compared with model group and vehicle control group, the VMR were significantly decreased at 0.8 ml, 1.2 ml in bifidobacterium group(P<0.01),and the MCT positive mast cells,BDNF expression and tryptase levels were decreased significantly(P<0.01orP<0.05).ConclusionThe increased expression of BDNF may contribute to visceral hypersensitivity in maternal-separated rats, which can be reversed by bifidobacterium.

brain-derived neurotrophic factor(BDNF);visceral hypersensitivity;bifidobacterium;maternal separation

“十二·五”國家科技支撐計劃子課題資助項目(2012BAJl8B03-03)

許紹嫻，女，1991-01生，在讀博士，E-mail：xushaoxian2013@163.com

2016-04-14

R574

A

1007-6611(2016)08-0715-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.009