紫草素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞雌激素受體的表達(dá)和增殖及凋亡的影響

陳玉忠， 韓福生， 許　磊， 張智瑞， 潘　瓊， 劉　浩， 金功圣*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，蚌埠　233000； 2蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系； *通訊作者，E-mail:jgs2007@qq.com)

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紫草素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞雌激素受體的表達(dá)和增殖及凋亡的影響

陳玉忠1， 韓福生1， 許磊1， 張智瑞2， 潘瓊2， 劉浩2， 金功圣1*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，蚌埠233000；2蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系；*通訊作者，E-mail:jgs2007@qq.com)

目的探討紫草素(shikonin，SK)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞雌激素受體表達(dá)及其對細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。方法用MTT法檢測不同濃度SK(0，1，2，4，8 μmol/L)處理MCF-7細(xì)胞24，48，72 h的增殖抑制作用；集落克隆形成實驗觀察低濃度SK(0，0.1，0.2，0.4 μmol/L)對MCF-7細(xì)胞增殖的影響；DAPI染色觀察SK處理24 h對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響；流式細(xì)胞術(shù)(PI單染法)檢測不同濃度SK(0，1，2，4，8 μmol/L)作用MCF-7細(xì)胞24 h細(xì)胞凋亡比率；Western blot法檢測SK對雌激素受體表達(dá)的影響。結(jié)果SK作用于MCF-7后細(xì)胞存活率隨濃度增加而降低(P<0.05)。0.1，0.2，0.4 μmol/L SK作用MCF-7細(xì)胞后抑制集落克隆形成，0.1，0.2，0.4 μmol/L SK組分別與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DAPI熒光染色結(jié)果顯示，隨SK濃度(1，2，4，8 μmol/L)增加，濃縮深染致密狀的細(xì)胞核數(shù)目逐漸增加。不同濃度的SK(1，2，4，8 μmol/L)作用于MCF-7細(xì)胞凋亡率分別為(7.0±1.27)%，(11.6±1.45)%，(15.1 ±1.36)%，(29.5±1.41)%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MCF-7細(xì)胞株中雌激素受體的表達(dá)隨SK濃度的增加而降低；2，4 μmol/L組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論SK可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與雌激素受體表達(dá)降低有關(guān)。

紫草素；乳腺癌;MCF-7細(xì)胞；增殖；凋亡；雌激素受體

乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤，同時是引起女性腫瘤相關(guān)死亡的首要原因[1]。其中死于雌激素受體(ER)陽性的乳腺癌患者明顯高于HER2陽性及三陰性乳腺癌患者[2]。雌激素及雌激素受體在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用。因此，針對ER的靶向治療藥物如他莫昔芬、氟維司群等已在ER陽性乳腺癌患者中應(yīng)用[3]，而乳腺癌內(nèi)分治療過程中耐藥[4]的產(chǎn)生，不得不尋求其他可能有效的治療手段。紫草作為一種抗炎、抗腫瘤藥物，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，紫草素(shikonin, SK)可從紫草科植物中提取。有報道稱其可對多種腫瘤細(xì)胞株產(chǎn)生作用。本研究以ER陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞株為研究對象，探討SK對MCF-7細(xì)胞的增殖、凋亡及其對雌激素受體表達(dá)的影響，以期為乳腺癌治療提供一些思路。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。SK、MTT購于Sigma公司(美國)，二甲亞砜(DMSO)(Biosharp公司，美國)，DMEM培養(yǎng)基粉末、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購于Gibco公司(美國)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)購于Sigma公司(中國)。兔抗ER抗體購于Proteintech公司(美國)，鼠抗β-actin抗體購于Biosharp公司(中國)，山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購于Santa Cruz Biotechnology公司(美國)。

恒溫CO2培養(yǎng)箱(Themo公司，美國)，Bio Tek酶標(biāo)儀(Synergy HT公司，美國)，Accuri C6流式細(xì)胞儀(Becton Dicknson公司，美國)，IX73倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)。ChemDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

用含10% FBS、10 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測細(xì)胞存活率

MCF-7細(xì)胞以6 000個/孔接種于96孔板中放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的SK(0，1，2，4，8 μmol/L)，每組4個復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。加入藥物24，48，72 h再加入15 μl MTT(5 mg/ml溶于PBS中)，放入CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，吸出96孔板內(nèi)液體并加入150 μl DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測每孔的吸光度。

1.4集落克隆形成實驗檢測SK對MCF-7細(xì)胞克隆形成的抑制作用

6孔板每孔接種5 500個細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別加入0，0.1，0.2，0.4 μmol/L的SK，培養(yǎng)5 d集落形成，除去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，用5%多聚甲醛固定后棄去多聚甲醛，加5%結(jié)晶紫染色并在室溫孵育10 min回收結(jié)晶紫，用雙蒸水清洗2次。室溫干燥，觀察藥物作用后集落形成情況，以此反應(yīng)藥物對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用。100倍顯微鏡下每組選取5個視野，統(tǒng)計集落個數(shù)(每個集落至少包含50個細(xì)胞)，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5DAPI染色法檢測SK對MCF-7凋亡的影響

以1.2×105細(xì)胞/孔接種于12孔板，培養(yǎng)24 h分別予每孔加入不同濃度SK(1，2，4，8 μmol/L)，給藥24 h吸盡培養(yǎng)液，加0.5 ml多聚甲醛固定10 min，去除固定液后用PBS洗2遍，3 min/次，避光條件下，加入DAPI染色30 min，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。

1.6PI單染法檢測SK作用后細(xì)胞的凋亡

12孔板中每孔接種1.4×105個細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度的SK(0，1，2，4，8 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收取細(xì)胞行PI染色用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7Western blot法檢測紫草素作用后雌激素受體的表達(dá)

應(yīng)用不同濃度的SK(1，2，4，8 μmol/L)作用于MCF-7細(xì)胞24 h，收取細(xì)胞，并用RIPA蛋白裂解緩沖液在冰上裂解30 min，置入4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心30 min，提取上清進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，蛋白封閉，分別孵育一抗、二抗并進(jìn)行曝光。使用Image J 軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行掃描，并做統(tǒng)計分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1SK對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT法檢測不同濃度SK(0，1，2，4，8 μmol/L)作用MCF-7細(xì)胞株24，48，72 h，MCF-7細(xì)胞的增殖明顯被抑制，隨著SK濃度的增加和作用時間的延長，藥物對細(xì)胞增殖抑制的作用增強(qiáng)(見圖1)，1，2，4，8 μmol/L SK作用相同分別與對照組(0 μmol/L SK)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相同濃度SK作用后分別與前一時段比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2SK對MCF-7細(xì)胞克隆形成的抑制作用

分別用0，0.1，0.2，0.4 μmol/L的SK處理MCF-7細(xì)胞5 d，與對照組相比MCF-7細(xì)胞株中雌激素受體的表達(dá)隨SK濃度的增加而降低，藥物作用組的細(xì)胞集落克隆數(shù)逐漸減少(見圖2A)。100倍視野下統(tǒng)計形成集落數(shù)，各組分別與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2B)。

與對照組(0 μmol/L)相比，*P<0.05；與24 h比較，#P<0.05；與48 h相比，P<0.05圖1　SK對MCF-7細(xì)胞存活率的影響Figure 1　The effect of SK on cell viability in MCF-7 cells treated with SK

2.3DAPI染色檢測SK對MCF-7凋亡的作用

在分別使用1，2，4，8 μmol/L SK作用24 h，DAPI染色檢測SK作用細(xì)胞后細(xì)胞核的變化，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，與對照組相比，細(xì)胞密度逐漸降低，細(xì)胞核呈現(xiàn)出濃染致密的固縮形態(tài)及顆粒狀熒光，隨著SK濃度增加，濃縮深染致密狀的細(xì)胞核數(shù)目也逐漸增加(見圖3，紅色箭頭所示)。

2.4PI染色檢測SK對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

在不同濃度SK作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞株24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

圖2　SK對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用Figure 2　Inhibition of SK on colony formation of MCF-SK 7 cells

圖3　SK對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Figure 3　The effect of SK on apoptosis of MCF-7 cells

2.5SK對MCF-7細(xì)胞株雌激素受體表達(dá)的影響

Western blot 條帶結(jié)果顯示，SK作用于MCF-7細(xì)胞后ER的表達(dá)降低(見圖5A)。測定灰度值并計算出分別應(yīng)用1，2，4 μmol/L SK后，MCF-7細(xì)胞中ER的相對表達(dá)量分別是1.71±0.205,1.12±0.097,0.92±0.160,0.56±0.147(見圖5B);ER抑制率分別是為(34.38±5)%、(44.24±15)%、(65.64±12)%。與對照組相比，應(yīng)用2 μmol/L及4 μmol/L SK組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01，見圖5B)。

圖4　SK對MCF-7細(xì)胞凋亡的作用Figure 4　The apoptosis induced by SK in MCF-7 cells

圖5　SK作用于MCF-7細(xì)胞24 h雌激素受體的表達(dá)Figure 5　Expression of estrogen receptor in MCF-7 cells after treated by SK for 24 h

3　討論

中藥紫草提取物SK及其衍生物可通過Bax/Bcl-XL，MAPK，HIF-1，TRAP1，Nur77/Bcl-2，NF-κB以及ROS的參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且可以引起腫瘤細(xì)胞壞死，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，抗血管增生等[5]。并且，SK可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞株凋亡，如人早幼粒細(xì)胞白血病HL60細(xì)胞株[6]、人肝癌細(xì)胞株Hep-1細(xì)胞[7]、人惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375-S2[8]、人結(jié)腸癌細(xì)胞[9]及宮頸癌細(xì)胞株[10]的凋亡，并且明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11,12]。文獻(xiàn)報道SK聯(lián)合他莫昔芬(tamoxifen，TAM)對乳腺癌細(xì)胞株有明顯抑制作用[11]。

在對乳腺癌藥物干預(yù)的探究中，SOFT和TEXT臨床實驗表明，降低機(jī)體內(nèi)雌激素的作用有助于改善患者的生存狀況[13]，然而一部分病人在內(nèi)分泌治療中產(chǎn)生耐藥[4]，SK的抗腫瘤作用可能與乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥存在共同的作用分子[14,15]。

在Yao等進(jìn)行的研究中，SK聯(lián)合TAM對MCF-7細(xì)胞存活率的抑制較單藥應(yīng)用效果明顯增強(qiáng)[11]。本研究應(yīng)用SK作用于ER陽性乳腺癌細(xì)胞MCF-7后，細(xì)胞增殖明顯被抑制，并且隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞凋亡比例也逐漸增加。Western blot法中檢測到隨著SK濃度的增加，蛋白條帶顯示ER表達(dá)降低。在動物實驗中SK抑制腫瘤的情況較好，但在應(yīng)用之后出現(xiàn)了體重減輕等副作用[16]。雖然SK聯(lián)合TAM對MCF-7細(xì)胞株的作用強(qiáng)于單藥[11]，但考慮到SK副作用帶來的不良影響[16]，應(yīng)用時或許需要降低SK劑量，本研究中較低濃度的SK對MCF-7細(xì)胞株的增殖抑制及凋亡作用不明顯；本研究中SK可以降低ER表達(dá)，ER是TAM作用靶點，在低劑量SK聯(lián)合TAM進(jìn)行治療時，可能會因為SK劑量低而使其抗腫瘤作用不明顯，SK又可降低ER表達(dá)而使TAM不能充分發(fā)揮作用。然而，本研究的不足之處在于，未在分子水平上進(jìn)行針對ER的干擾或過表達(dá)等實驗。隨后可以進(jìn)行動物體內(nèi)實驗來探究SK的抗腫瘤效果及抗腫瘤機(jī)制。

以上研究結(jié)果提示，SK可以抑制乳腺癌MCF-7的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與降低ER的表達(dá)有關(guān)。本研究為中藥提取物SK用于治療乳腺癌提供了一些思路和理論支持。

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Effects of shikonin on proliferation, apoptosis and expression of estrogen receptor in breast cancer MCF-7 cells

CHEN Yuzhong1, HAN Fusheng1, XU Lei1, ZHANG Zhirui2, PAN Qiong2, LIU Hao2, JIN Gongsheng1*

(1DepartmentofSurgicalOncology,FirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China;2FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:jgs2007@qq.com)

ObjectiveTo investigate the effect of shikonin(SK) on the expression of estrogen receptor(ER) and the proliferation and apoptosis in breast cancer cell line MCF-7.MethodsMCF-7 cells were exposed to different concentrations(0,1,2,4,8 μmol/L) of SK for 24, 48 and 72 h and the cell viability was assessed with MTT assay. The nuclear changes in MCF-7 cells treated with SK were observed under fluorescent microscope. The apoptotic cell after treated with 0,1,2,4,8 μmol/L SK for 24 h was quantified by flow cytometry. Colony formation assay was used to detect the proliferation of MCF-7 cells after treated with SK.Western blot was used to detect the expression of ER in MCF-7 cells after SK treatment.ResultsThe cell viability of MCF-7 cells decreased in a concentration-dependent manner after treated with SK(P<0.05). Low levels(0.1,0.2,0.4 μmol/L) of SK inhibited cell colony formation,and the number of colony formation of MCF-7 cells was significantly decreased in 0.1，0.2，0.4 μmol/L SK groups compared with control group(P<0.05). DAPI staining showed that MCF-7 cell nucleus became condensed and deep-stained gradually after treated with 1,2,4,8 μmol/L SK. The apoptotic rate was(7.0±1.27)%,(11.6±1.45)%, (15.1±1.36)% and (29.5±1.41)% in MCF-7 cells treated with 1,2,4,8 μmol/L SK, respectively, which was significantly higher than in control group(P<0.05). The expression of ER in MCF-7 cells treated with SK was decreased, and a significant difference was detected in MCF-7 cells exposed to 2, 4 μmol/L SK compared with control group(P<0.05).ConclusionSK could inhibit the proliferation and induce the apoptosis in MCF-7 cells, which may be related to down-regulation of the expression of estrogen receptor.

shikonin;breast cancer;MCF-7;proliferation;apoptosis;estrogen receptor

國家自然科學(xué)基金資助項目( 81372899)；安徽省自然科學(xué)基金資助項目(1508085MH166)

陳玉忠，男，1990-02生，碩士，E-mail：cyz0903@foxmail.com

2016-06-08

R737.9

A

1007-6611(2016)08-0724-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.011