16S rDNA測序在兒童自發性細菌性腹膜炎病原學診斷中的作用

黃君華， 黃鳳霞， 張書婉， 余建華

(1西安醫學院醫學技術系，西安　710021； 2西安市兒童醫院檢驗科)

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16S rDNA測序在兒童自發性細菌性腹膜炎病原學診斷中的作用

黃君華1， 黃鳳霞1， 張書婉2， 余建華2

(1西安醫學院醫學技術系，西安710021；2西安市兒童醫院檢驗科)

目的探討Sanger法測序用于快速鑒定兒童自發性細菌性腹膜炎病原菌的價值。方法用臨床常見的16種細菌和3種真菌及人類基因組DNA驗證一對新的16S rDNA通用引物PSL/P13P的特異性和敏感性；收集86例疑似自發性細菌性腹膜炎兒童的腹水標本5 ml，其中4 ml常規細菌培養，剩余1 ml用于提取細菌DNA進行16S rDNA-PCR；對陽性擴增產物進行測序并通過BLAST比對鑒定菌種，與培養鑒定結果進行比較。結果3種真菌及人類基因組PCR均為陰性，16種細菌PCR陽性，PSL/P13P的檢測下限為102CFU/ml。86例標本培養陽性率26.7%(23/86)，PCR陽性率45.3%(39/86)，二者差異具有統計學意義(χ2=14.06，P<0.05)。在37例PCR及測序陽性標本中，革蘭陰性桿菌占73.0%(27/37)，以大腸埃希菌為主(14/37，占37.8%)，革蘭陽性球菌占27.0%(10/37)，其中腸球菌最多(7/37，占18.9%)。結論通用引物PSL/P13P具有良好的特異性和敏感性，檢出率較常規培養方法高，結合測序能很好地鑒定自發性細菌性腹膜炎病原菌，可作為一種新的檢測技術和流行病學方法在臨床應用；兒童自發性細菌性腹膜炎病原菌以革蘭陰性桿菌為主，尤以大腸埃希菌最常見。

自發性細菌性腹膜炎；16S核糖體核糖核酸；細菌；測序；兒童

自發性細菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)又稱原發性腹膜炎，是指在腹腔內無明確感染灶的情況下發生細菌性腹膜感染及炎癥。該病死亡率高，嚴重威脅患兒生命健康，因此對SBP的早期病原學診斷十分重要[1]。目前，SBP病原菌鑒定主要依靠腹水培養，耗時長，陽性率低，不能滿足臨床早期有針對性應用抗菌藥物的需求。PCR結合測序法能直接從體液標本中快速準確地鑒定病原菌，具有良好的應用前景，而且對流行病學研究意義重大[2]。本研究旨在通過對疑似SBP的腹水標本同時進行培養和16S rDNA-PCR，比較二者在陽性率和病原菌分布上的差異，為兒童SBP早期快速的病原學診斷提供新方法。

1　材料與方法

1.1一般資料

實驗菌株：大腸埃希菌，銅綠假單胞菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯菌，產酸克雷伯菌，陰溝腸桿菌，洋蔥伯克霍爾德菌，嗜麥芽窄食單胞菌，奇異變形桿菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，屎腸球菌，糞腸球菌，鼠李糖乳桿菌及白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌，共16種細菌、3種真菌。實驗菌株按要求分離并純化，經西安市兒童醫院檢驗科微生物室VITEK compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定。收集2014-01～2015-12在西安市兒童醫院兒科重癥監護室(PICU)、消化內科、普外科、腎內科等多個科室86份臨床懷疑SBP的腹水標本各5 ml，其中4 ml用全自動血培養儀BACK-ALERT 3D進行培養，陽性經VITEK鑒定到種，剩余1 ml提取細菌DNA。另采集1名健康人全血2 ml，提取人類基因組DNA。1.2方法

1.2.1標本采集在嚴格無菌操作下，用一次性無菌注射器穿刺腹腔，抽取腹水5 ml，其中4 ml注入血培養瓶中進行培養，剩余1 ml注入EDTA-K2抗凝管并放入4 ℃冰箱暫存，用于提取DNA。

1.2.2細菌DNA提取及PCR擴增將1 ml腹水標本12 000 r/min離心5 min，取沉淀，應用QIAamp Blood DNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN，Cat. No.51106)，具體操作步驟見文獻[2]。引物序列參照文獻[3，4]設計，上游引物PSL(f)：5′-AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA-3′,下游引物 P13P (r)：5′-AGGCCCGGGAACCGTATCCAC-3′，擴增產物大小為607 bp。25 μl PCR反應體系：10×buffer 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.25 μl，25 mmol/L MgCl22.5 μl，3.3 μlmol/L PSL、P13P各0.5 μl，Taq酶(5 U/μl)0.125 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 17.625 μl。PCR程序：預變性96 ℃ 10 min；96 ℃變性1 min，退火溫55 ℃1 min，延伸72 ℃1 min，共30個循環；最后72 ℃ 延伸7 min，4 ℃保存。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3制備梯度菌液為檢測新引物敏感度，本研究用1麥氏單位(約3×108CFU/ml)的大腸埃希菌菌液100 μl加入200 μl純水，得到約108CFU/ml的菌液，然后進行1∶10倍比稀釋，取106，107，108三個稀釋度的菌液涂布平板，每個稀釋度3個平板，每個平板涂100 μl，37 ℃培養24 h后計數菌落，選用3個平板的平均菌落數作為參考菌數。DNA提取、PCR反應體系及條件同上。

1.2.4測序比對擴增產物送上海生工生物工程有限公司測序，登陸http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，將測序結果在GenBank中進行BLAST比對。

1.2.5統計學處理應用SPSS 17.0進行數據分析，采用配對四格表資料的卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.116S rDNA-PCR特異性

16種細菌的DNA經引物PSL/P13P擴增后均產生單一條帶，經與DNA標記物比對，產物大小和預期相符，而3種真菌及人類基因組DNA經擴增后無條帶(見圖1)。

2.216S rDNA-PCR敏感性

從梯度菌液(107-10 CFU/ml)中提取細菌DNA，用引物PSL/P13P擴增，檢測該對引物的敏感度。由圖2可見107-102CFU/ml均有擴增條帶且條帶隨菌量的遞減而逐漸變淺，7道無擴增條帶，說明該引物對菌量<102CFU/ml無法檢出，其檢測下限為102CFU/mL。

1.鼠李糖乳酸桿菌；2.大腸埃希菌；3.銅綠假單胞菌；4.鮑曼不動桿菌；5.肺炎克雷伯菌；6.產酸克雷伯菌；7.陰溝腸桿菌；8.洋蔥伯克霍爾德菌；9.嗜麥芽窄食單胞菌；10.奇異變形桿菌；11.金黃色葡萄球菌；12.表皮葡萄球菌；13.溶血葡萄球菌；14.人葡萄球菌；15.屎腸球菌；16.糞腸球菌；17.白假絲酵母菌；18.熱帶假絲酵母菌；19.光滑假絲酵母菌；20.人類基因組DNA；21.PCR陰性對照圖1　通用引物PSL/P13P特異性檢測結果Figure 1　The specificity of the universal primer(PSL/P13P)

1-7分別為107, 106，105，104，103，102，10 CFU/ml；8.PCR陰性對照圖2　通用引物PSL/P13P敏感度結果Figure 2　The sensitivity of the universal primer (PSL/P13P)

2.3通用引物PCR檢測臨床標本

用引物PSL/P13P擴增86例疑似SBP的臨床標本。部分標本擴增結果見圖3，其中5,7,10為擴增陽性，3,4,6,8,9,11,12為擴增陰性。提取陰性對照為正常人外周血，提取陽性對照為正常人外周血加入鼠李糖乳桿菌(細菌終濃度102CFU/ml)，PCR陽性對照為事先提取好的鼠李糖乳桿菌基因組DNA。

1.PCR陰性對照；2.提取陰性對照；3，4，6，8，9，11，12.陰性標本；5，7，10.陽性標本；13. 陽性對照(鼠李糖乳桿菌)；14.PCR陽性對照(鼠李糖乳桿菌DNA)圖3　通用引物PSL/P13P檢測部分標本電泳結果圖Figure 3　PCR results of the clinical specimens amplified by PSL/P13P

2.4兩種不同方法檢測結果

86例標本培養陽性23例(26.7%)，PCR陽性39例(45.3%)，兩種方法檢測陽性率經卡方檢驗，二者差異有統計學意義(χ2=14.06，P<0.05見表1)。

表116S rDNA-PCR與培養陽性率比較

Table 1Comparison of positive rate between 16S rDNA-PCR and culture results

PCR培養陽性陰性合計χ2P陽性23163914.06<0.05陰性04747合計236386

2.5PCR與培養檢出病原菌分布

86例樣本中23例培養陽性，其中2例培養出兩種菌(1例大腸埃希菌+屎腸球菌，1例大腸埃希菌+肺炎克雷伯菌)為混合感染，共檢出25種菌。PCR陽性39例，2例混合感染標本未得到測序結果(見表2)。

表2PCR與腹水培養病原菌分布株(%)

Table 2Positive results of ascites fluid bacteria pathogens diagnosed by PCR and culturestrain(%)

病原菌 PCR(n=37)培養(n=25)革蘭陰性菌27(73.0)18(72.0)大腸埃希菌14(37.8)10(40.0)肺炎克雷伯菌7(18.9)5(20.0)陰溝腸桿菌2(5.4)2(8.0)銅綠假單胞菌2(5.4)1(4.0)鮑曼不動桿菌1(2.7)0(0) 嗜麥芽寡養單胞菌1(2.7)0(0) 革蘭陽性菌10(27.0)7(28.0)屎腸球菌4(10.8)3(12.0)糞腸球菌3(8.1)3(12.0)金黃色葡萄球菌2(5.4)1(4.0)表皮葡萄球菌1(2.7)0(0)

3　討論

自發性細菌性腹膜炎(SBP)的發病機制主要是菌群移位(bacterial translocation，BT)，腸壁通透性增高、腸腔內細菌過度繁殖及免疫功能異常是引起 BT 的主要環節。SBP的診斷主要依靠實驗室檢測[5]，最直接的證據是腹水培養細菌陽性，然而培養法的低敏感度，往往得不到實驗結果[6]，其所得到的病原菌分布資料與客觀情況有較大差異[7]。分子生物學的發展，尤其是PCR技術的出現，為細菌性感染的診斷帶來新的途徑[8,9]。

本研究選取疑似SBP患兒作為研究對象，共收集86份標本，應用一對新的16S rDNA通用引物PSL/P13P，實驗證明該引物具有很好的特異性，不會將真核細胞(真菌和人類)的DNA擴增出來；檢測靈敏度較高，能夠達到102CFU/ml，但對于菌含量低于102CFU/ml則無法檢出，后期可應用敏感度更高的熒光定量PCR方法檢測，以提高檢出率。另外，為了盡量避免由污染導致的假陽性，保證檢測結果客觀真實，本研究每次實驗時都設置提取陰性對照和PCR陰性對照，陽性對照用不會引起人體感染的鼠李糖乳酸菌。86份標本中，培養陽性23例，共檢出25株細菌，PCR陽性39例，共得到37份測序結果，PCR陽性率(45.3%)是培養陽性率(26.7%)的1.7倍，二者差異有統計學意義(表1)，顯示PCR檢測陽性率高于培養法。其中2例經培養為兩種菌，分別檢出大腸埃希菌+屎腸球菌和大腸埃希菌+肺炎克雷伯菌，而這2例經16S rDNA-PCR擴增也為陽性，但測序無法得到結果，原因可能是基于Sanger法的測序儀無法對混合擴增子進行準確測序，說明僅靠16S rDNA-PCR結合測序無法檢測混合細菌感染，但可通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)進行鑒別[10]。可見PCR所得到的病原菌分布與培養結果略有差異，PCR檢測的病原菌種類多于培養法，如果增加樣本量并避免假陽性，則PCR所得到的統計學結果能更加客觀全面地反映SBP病原菌分布。

從表2可以看出，經PCR方法檢測，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌、糞腸球菌共占SBP病原菌的75.7%，其中大腸埃希菌居兒童SBP病原菌首位，占37.8%；革蘭陽性球菌占27.0%，以腸球菌屬為主(18.9%)；革蘭陰性桿菌占73.0%，是引起兒童SBP的主要病原菌，與陳維蓓等[11]報道的腹水感染病原菌基本一致，也與金炎等[12]報道的復雜性腹腔感染流行病學資料一致。

綜上所述，本研究直接從腹水中提取細菌基因組DNA，并應用通用引物PCR擴增細菌16S rRNA基因部分片段，通過測序來快速鑒定SBP病原菌，為獲得更加客觀真實的SBP感染細菌菌譜提供了一種新的思路和方法，并有利于更快速地檢測病原菌和及時地選擇抗生素。

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Clinical value of the 16S rDNA sequencing in diagnosis of spontaneous bacterial peritonitis in children

HUANG Junhua1, HUANG Fengxia1, ZHANG Shuwan2, YU Jianhua2

(1DepartmentofMedicalTechnology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2ClinicalLaboratory,Xi’anChildren’sHospital)

ObjectiveTo explore the value of Sanger sequencing for rapidly identifying pathogenic bacteria-caused spontaneous bacterial peritonitis(SBP) in children.MethodsThe specificity and sensitivity of a new pair of 16S rDNA primer(PSL/P13P) was validated using 16 kinds of bacteria, 3 kinds of fungi and human DNA. Eighty-six children with suspected SBP were included. The 5 ml ascetic fluid was collected, of which, 4 ml ascetic fluid was cultured and the rest 1 ml was used for DNA extraction following by 16S rDNA-PCR. The positive PCR results were sequenced and identified by BLAST, and then compared with the culture results.ResultsPCR products from 3 kinds of fungi and human DNA were negative, and PCR products from 16 kinds of bacteria were positive. The lowest detectable limit of PSL/P13P was 102CFU/ml. Of 86 cases of ascites, the positive rate was 26.7%(23/86) for culture results and 45.3%(39/86) for PCR results, and there was a significant difference between the two methods(χ2=14.06,P<0.05). In 37 samples of positive PCR and sequencing results, Gram-negative bacillus accounted for 73.0%(27/37), which mainly was Escherichia coli(14/37，37.8%);Gram-positive coccus accounted for 27.0%, and the predominant pathogen was Enterococcus(7/37，18.9%).ConclusionThe universal primers PSL/P13P has good specificity, sensitivity and higher detection rate, and its combination with sequencing can detect pathogenic bacteria-caused SBP very well. So it can be used as a new detection technology and epidemiological investigation method in the clinical practice. The pathogens causing SBP in children are mainly Gram-negative bacteria, andEscherichiacoliis the most common one.

spontaneous bacterial peritonitis;16S rDNA;bacteria;sequencing;child

西安醫學院青年科研基金資助項目(2015QN09)

黃君華，男，1985-08生，碩士，講師，E-mail：huangjunhua1985@163.com

2016-05-20

R572.2

A

1007-6611(2016)08-0764-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.020