大孔吸附樹脂純化制備京尼平苷酸的研究

商　鋒,尹　勝,2,肖　瀟,王成濤,2,*,文雁君

(1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048;2.食品質量與安全北京實驗室,北京 100048;3.河南中大生物工程有限公司,河南鄭州 451162)

?

大孔吸附樹脂純化制備京尼平苷酸的研究

商鋒1,尹勝1,2,肖瀟1,王成濤1,2,*,文雁君3

(1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048;2.食品質量與安全北京實驗室,北京 100048;3.河南中大生物工程有限公司,河南鄭州 451162)

研究了大孔吸附樹脂從梔子黃色素生產廢液的京尼平苷堿水解液中純化制備京尼平苷酸(GPA)的影響因素及工藝條件,比較了大孔吸附樹脂對GPA的脫色、吸附及解吸附性能,確定了最佳制備工藝。結果表明,弱極性DA201樹脂的脫色效果較好,且對GPA的吸附性差;非極性樹脂DA201C對GPA的吸附率、解吸率較高,分別達到88.7%、98%。在樹脂用量1 g/25 mL 10 mg/mL GPA粗提液稀釋液、pH 4.0、25 ℃、120 r/min振蕩6 h的條件下,DA201樹脂的脫色率為85.9%,GPA保留率為92.3%。DA201C樹脂高效吸附GPA的條件為10 mg/mL脫色液、pH3.0、上樣速度1 BV/h、上樣量7.2 BV。經25%乙醇溶液洗脫、干燥,制備的GPA純度達到95.1%,回收率為86.2%。上述結果表明,在GPA的分離純化中,DA201適用于脫色,DA201C適用于吸附和解吸。

京尼平苷,京尼平苷酸,大孔樹脂,脫色,純化

京尼平苷酸(GPA,圖1A)屬環烯醚萜類化合物,具有抗腫瘤[1]、抗衰化[2]、消炎利膽[3]、降血壓[4]等藥理作用,日本健康衛生部已將其作為一種保健食品添加劑。GPA經β-葡萄糖苷酶酶解脫糖后形成殘基,再與不同的氨基化合物進行顯色反應,可生成梔子紅色素和梔子紫色素[5-7]兩種具有重要開發價值的食用色素。在梔子、車前子、杜仲等植物含有一定量的GPA,可通過溶劑浸提后再用硅膠柱、制備色譜或大孔吸附樹脂純化得到[8-10]。由于上述原料的GPA含量極低,提取工藝相對復雜,難以規模化生產和滿足市場需求。利用梔子黃色素生產廢液轉化是GPA制備的一種有效途徑,梔子黃色素生產廢液中含有豐富的京尼平苷(GP,圖1B),通過堿水解GP、樹脂純化可制備GPA。此法不僅產量高、成本低,而且可以減小梔子黃色素廢液的污染、提高資源利用率。

梔子黃廢液中殘存的梔子黃色素以及堿水解附帶產生的雜色素是影響GPA色澤、純度的主要因素之一。本文通過堿水解梔子黃廢液提取物制備GPA粗提液,然后經過大孔吸附樹脂,得到GPA純化產品。本文的目的是探究大孔吸附樹脂的脫色、吸附-解吸附等工藝對GPA制備純度、回收率等方面的影響,旨在為系列梔子色素的研發提供材料。

圖1　京尼平苷酸和京尼平苷的結構式Fig.1　Structural formula of geniposidic acid and geniposide

1　材料與方法

1.1材料與儀器

GP和GPA(純度≥98%)四川省維克奇生物科技有限公司;梔子黃生產廢液提取物(含GP 90.73%)河南中大生物工程有限公司;GDX201、DA201、A型、H103、D101、S-8、HPD100A、HPD450、AB-8大孔吸附樹脂鄭州勤實科技有限公司;DA201C、HPD100、HZ816大孔吸附樹脂上海一基實業有限公司;甲醇(色譜純)賽默飛世爾科技(北京)有限公司;其他試劑均為國產分析純。

20AT型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外可見光分光光度計日本島津公司;IKA RV10旋轉蒸發儀德國IKA公司;FD-1B-80型冷凍干燥機南京普森儀器;HQ45型恒溫搖床中國科學院武漢科學儀器廠;WE-1水浴恒溫振蕩器天津市歐諾儀器儀表有限公司;玻璃層析柱(26 mm×40 mm)北京瑞達恒輝科技發展有限公司;FE20型pH計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;AKTA prime plus內置泵通用電氣GE公司。

1.2實驗方法

1.2.1樹脂的預處理[11]將樹脂用無水乙醇浸泡至充分溶脹,去除乙醇后用蒸餾水洗滌至無白色渾濁且無醇味,接著依次用5% NaOH溶液和5% HCl溶液浸泡3 h,最后用蒸餾水洗滌至中性,減壓抽濾并在50 ℃下烘干,備用。

1.2.2GPA粗提液的制備準確稱取一定質量的梔子黃生產廢液提取物,加入兩倍質量的蒸餾水,攪拌溶解,調節pH11.0,置于80 ℃的水浴搖床中,100 r/min,水解5 h。每隔20 min用10 mol/L NaOH溶液和10 mol/L的鹽酸溶液調節一次pH,控制pH11.0±0.05。堿解結束后,冷卻至室溫,檸檬酸溶液調節pH3.0,抽濾去除不溶物,獲得GPA粗提液,4 ℃保存備用。

1.2.3GPA的HPLC檢測色譜柱為Sepax HP-C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),流動相為甲醇∶水=70∶30,檢測波長237 nm,流速0.6 min/mL,柱溫30 ℃,進樣量5 μL。

1.2.4樹脂的篩選分別稱取1.00 g預處理好的樹脂,置于250 mL的三角瓶,加入50 mL GPA粗提液的稀釋液(0.876 mg/mL),pH3.0、25 ℃、120 r/min條件下振蕩24 h,測定脫色率、吸附率、吸附量。除去吸附后的殘液,得到吸附飽和的樹脂,向三角瓶中分別準確加入50 mL 95%的乙醇溶液,25 ℃,120 r/min條件下振蕩24 h。計算解吸率。綜合比較粗選出搖瓶脫色樹脂和吸附-解吸GPA樹脂。參考文獻[12]方法,脫色率和解色率的計算公式如下:

式中,A前、A后、A解分別表示脫色前、脫色后及解吸液在450nm波長下溶液的吸光度值;V始、V解分別表示初始液和解吸液的體積。

吸附量、吸附率與解吸率計算公式如下:

式中,C0-起始質量濃度(mg/mL),CC-平衡質量濃度(mg/mL),V1-吸附液體積(mL),m-樹脂質量(g),C-解吸液質量濃度(mg/mL),V-解吸液體積(mL)。

1.2.5不同樹脂對GPA粗提液脫色效果稱取1.00g預處理好的脫色樹脂,置于100mL的三角瓶,加入25mLGPA粗提液稀釋液(10mg/mL),調節pH、25 ℃、120r/min條件下振蕩一定時間,計算其脫色率、GPA保留率,繪制靜態吸附動力學曲線,考察pH對脫色效果的影響。GPA保留率的計算公式如下:

式中,C后、C前分別表示脫色前后溶液中GPA的濃度。

1.2.6GPA的吸附與解吸附

表1　大孔吸附樹脂的粗篩對GPA的吸附、解吸附及脫色效果

1.2.6.1GPA的靜態吸附與解吸分別稱取1.00 g預處理好樹脂,置于250 mL三角瓶,加入50 mL脫色后的GPA稀釋液(0.876 mg/mL),調一定pH、25 ℃、120 r/min條件下振蕩一定時間,計算脫色率、GPA吸附率,確定適宜樹脂和pH,考察乙醇濃度對GPA脫附效果的影響。

1.2.6.2GPA的動態吸附與解吸將預處理好的樹脂濕法裝入玻璃層析柱(裝柱量約385 mL),上樣脫色后稀釋液,上樣濃度10 mg/mL、pH 3.0、速度1 BV/h(BV為柱體積),收集器收集流出液(0.1 BV/管),繪制動態吸附曲線,確定適宜上樣液用量。上樣結束后用1.5 BV的去離子水淋洗除雜,淋洗速度為2.5 BV/h。洗脫液洗脫,洗脫速度為0.5 BV/h,分管收集流出液(0.1 BV/管),繪制動態洗脫曲線,確定洗脫液用量。

1.2.7樹脂重復利用次數根據1.2.5、1.2.6確定方法,在相同樹脂柱上重復上柱、淋洗、洗脫,收集洗脫液濃縮、凍干,分別測定凍干粉中GPA的純度、回收率,確定樹脂的重復利用次數。

1.2.8統計分析測定結果以平均值±標準差(SD)(n=3)表示,利用SPSS17.0軟件對實驗數據進行單因素分析,置信度為95%(α=0.05),3次實驗重復。

2　結果與討論

2.1GPA的線性考察

按照1.2.3節方法測定GPA的含量并考察線性關系。結果表明,當GPA的進樣濃度X在2.5～15 μg/mL之間時,與峰面積Y呈良好的線性關系,線性方程Y=7857.7X+3064.1(R2=0.9995)。

2.2大孔吸附樹脂的粗篩

不同性質化合物因其在大孔吸附樹脂上具有不同的吸附、解吸附能力,從而實現其分離純化。選擇不同極性、比表面積、孔徑大小等12種大孔樹脂,研究考察其對GPA化制備過程中的脫色、吸附、解吸能力。表1可知,12種樹脂的脫色、吸附性、解吸性效果存在較大差異,其中DA201、HPD100、A型、S-8等4種樹脂脫色率均高于95.0%;DA201樹脂的脫色效果較好,且對GPA的吸附率僅為14.4%;非極性樹脂DA201C和H103對GPA的吸附率、解吸率分別達到88.7%、98%和88.9%、98.4%,但對色素也有較高吸附性。因此確定采用DA201樹脂先進行脫色,再用DA201C或H103樹脂吸附、解吸附GPA的制備工藝。

2.3條件優化對GPA粗提液搖瓶脫色效果的影響

2.3.1吸附時間對搖瓶脫色效果的影響GPA粗提液稀釋液(10 mg/mL)置于預處理好的DA201樹脂中,25 ℃、120 r/min振蕩一定時間,其脫色效果見圖2。DA201樹脂對GPA的吸附在1 h時基本達到飽和,GPA保留率保持在86.4%左右;隨時間延長DA201樹脂吸附色素不斷增加,6 h時達到飽和,脫色率為77.2%。肖麗霞等[13]在研究脫色時間與香菇多糖脫色率的關系時也得到類似的變化趨勢,可見吸附時間是影響脫色效果的一個重要因素。選擇6 h作為搖瓶脫色時間。

圖2　吸附時間對脫色效果的影響Fig.2　Effect of adsorption time on the decolorization efficiency of resin DA201

2.3.2pH對樹脂脫色效果的影響圖3顯示,GPA稀釋液pH4.0～10.0條件下GPA保留率變化不大,均高于90.2%;隨著其稀釋液pH增加,脫色率顯著不同(p<0.05),呈先增加后降低的趨勢。pH4.0時,脫色效果最好,脫色率達91.7%。

圖3　pH對脫色效果的影響Fig.3　Effect of pH on the decolorization efficiency of resin DA201

2.3.3脫色驗證實驗按上述確定的脫色條件,調pH4.0,25 ℃,120 r/min振蕩6 h,3組平行實驗,分別計算各組溶液的脫色率及GPA保留率。結果表明,DA201樹脂對GPA的保留率為(92.3±0.018)%,脫色率為(85.9±0.013)%,脫色效果較好。李國平等[14]采用FD802樹脂對梔子黃廢液進行脫色處理,得到梔子黃色素的去除率高于91%,本實驗的結果低于這一水平,猜測原因是由于GPA粗提液中除含有大量的梔子黃色素外,還含有少量因高溫堿水解附帶產生的雜色素,其不易被樹脂吸附,從而降低了脫色率。

2.4條件優化對GPA吸附和解吸附性能的影響

2.4.1GPA的靜態吸附與解吸附作用

2.4.1.1DA201C和H103樹脂對GPA靜態吸附作用DA201C和H103樹脂的吸附率均隨吸附時間的延長而逐漸提高(圖4),8 h時吸附作用基本達到飽和,兩種樹脂對GPA的吸附率均在92%左右。考慮到前8 h,樹脂DA201C對GPA的吸附速率和吸附量明顯高于H103,因此確定DA201C樹脂作為吸附-解吸GPA的樹脂。謝鍵泓等[15]比較不同大孔吸附樹脂吸附-解吸GPA的性能,表明樹脂H103效果最好,本實驗經考察發現樹脂DA201C吸附-解吸GPA的效果優于H103。

圖4　靜態吸附GPA動力學曲線Fig.4　The static adsorption dynamic curves of GPA

2.4.1.2pH對DA201C樹脂吸附GPA能力的影響圖5表明,pH2.0～4.0,DA201C樹脂的吸附率無顯著性變化(p>0.05),均高于87.1%;pH4.0～8.0范圍時,隨著pH遞增DA201C對GPA的吸附率迅速下降。這可能是因為pH影響了化合物的解離度,GPA含有酸性羧基基團,在酸性條件下DA201C對解離的GPA具有更好交換吸附能力,提高了吸附率。曾超珍等[16]研究考察上樣液pH對AB-8樹脂吸附橙皮苷的影響時,也得到類似的結論。因此,選擇上樣液的pH=3.0。

圖5　pH對DA201C樹脂吸附GPA能力的影響Fig.5　Effect of pH on the adsorption efficiency of GPA by resin DA201C

2.4.1.3乙醇濃度對DA201C樹脂解吸附GPA性能的影響隨著乙醇濃度增加,GPA和色素均不斷解吸(圖6)。乙醇濃度>25%時,GPA解吸率增加緩慢,而色素解吸率卻增加顯著(p<0.05)。色素的解吸附影響GPA的色澤、純度,綜合考慮GPA解吸率、色素解吸率、節約乙醇等指標,選擇25%乙醇溶液作為洗脫液。

圖6　乙醇濃度對DA201C樹脂解吸附GPA性能的影響 Fig.6　Effect of ethanol concentration on the elution efficiency of GPA by resin DA201C

2.4.2GPA的動態吸附與解吸實驗

2.4.2.1GPA的動態吸附曲線GPA脫色液經DA201C樹脂柱的動態吸附曲線見圖7,上樣液量<6BV時,洗脫液中未檢測到GPA,表明DA201C樹脂尚未達到吸附飽和;上樣量>6 BV,洗脫液中GPA濃度逐漸增加;當上樣液量>7.5 BV時,洗脫液中GPA濃度顯著增加(p<0.05)。洗脫液中GPA的濃度為上樣液濃度的1/10時達到洗脫點[17],因此確定上樣體積為7.2 BV。

圖7　GPA的動態吸附曲線Fig.7　The dynamic adsorption kinetics curve of GPA

2.4.2.2GPA的動態洗脫曲線7.2 BV上樣體積的GPA脫色液經DA201C樹脂柱吸附后進行洗脫(圖8),隨著洗脫液用量的增加,GPA被不斷洗脫,洗脫峰尖銳且對稱。當洗脫液用量為1.1 BV時,GPA濃度達到最大值115.36 mg/mL。考慮減少乙醇用量,選擇洗脫液用量為2 BV,并收集0.6～2 BV范圍內的洗脫液濃縮、冷凍干燥。

圖8　GPA的動態洗脫曲線Fig.8　The dynamic elution kinetics curve of GPA

2.5樹脂的利用次數

DA201C樹脂經活化再生后可重復使用,但隨著分離純化樣品次數的增加,降低樹脂分離效果和目標成分回收率。圖9中DA201C樹脂重復使用4次時,京尼平苷酸純度>89.9%,回收率>86.2%;第5～6次時,GPA純度、回收率明顯下降(p<0.05),說明DA201C樹脂吸附基團及吸附雜質的累積明顯影響了樹脂吸附性能。本實驗得到的GPA純度、回收率高于曹慧[18]等報道的84.06%、77.18%,但略低于謝鍵泓等[15]報道的96.1%、95.2%。

圖9　樹脂使用次數對GPA純度和回收率的影響Fig.9　Effect of resin repeated uses on the recoveries and purities of GPA

3　結論

研究了大孔吸附樹脂純化制備GPA的影響因素及工藝條件。結果表明,在GPA的分離純化中,DA201樹脂適用于脫色,DA201C樹脂適用于吸附和解吸附。DA201樹脂的搖瓶脫色條件為樹脂用量1 g/25 mL 10 mg/mL GPA粗提液稀釋液、pH4.0、25 ℃、120 r/min振蕩6 h,該條件的GPA保留率為92.3%,脫色率為85.9%。DA201C樹脂吸附-解吸附制備GPA的條件為10 mg/mL脫色液、pH3.0、上樣速度1 BV/h、上樣量7.2 BV;上樣結束后,25%乙醇溶液洗脫,洗脫速度0.5BV/h,洗脫液用量2 BV,收集0.7～2.0 BV范圍內的洗脫液濃縮、干燥。按上述工藝樹脂重復使用次數為4次,GPA純度最高達95.1%。

[1]Hsu HY. Comparisons of geniposidic acid and geniposide on antitumor and radioprotection after sublethal irradiation[J]. Cancer Letters,1997,113(1):31-37.

[2]Li Y,Metori K,Koike K,et al. Improvement in the Turnover Rate of the Stratum Corneum in False Aged Model Rats by the Administration of Geniposidic Acid in Eucommia ulmoides Oliver Leaf[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin,1999,22(6):582-585.

[3]金鑫,孫靜,謝文莉,等. 京尼平苷酸對佐劑性關節炎大鼠抗炎作用及滑膜細胞凋亡機制研究[J].中國中藥雜志,2009,34(23):3082-3086.

[4]Takeshi D,Sansei N,Yoshihisa N. Constituents and Pharmacologieal effects of Eucommia and Siberian glnseng[J]. Acta Pharmacologica Sinica,2001,22(12):1057-1070.

[5]Fang S,Jiang W,Cao J,et al. Conversion Process of High Color Value Gardenia Red Pigment[J]. Lecture Notes in Electrical Engineering,2015.

[6]Moritome N,Kishi Y,Fujii S. Properties of red pigments prepared from geniposidic acid and amino acids[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,1999,79(6):810-814.

[7]陳小梅,黃為民,陳桂芳,等. 梔子紫色素制備及其穩定性研究[J].中國食品添加劑,2014,3:120-124.

[8]Deyama T,Ikawa T,Kitagawa S,et al. The Constituents of Eucommia ulmoides OLIV. IV. Isolation of a New Sesquilignan Glycoside and Iridoids(Organic,Chemical)[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin,1986,34(12):4933-4938.

[9]鄒登峰,何翠微,朱華,等. 制備色譜法制備京尼平甙酸[J]. 化學工程師,2005,120(9):7-8.

[10]李湘洲,胡文彬,張勝,等. 大孔吸附樹脂純化杜仲葉加工剩余物中的京尼平苷酸[J].光譜實驗室,2012,29(4):101-109.

[11]陳曉俠,宋淵,張紀柏,等. 吸附樹脂對蛹蟲草黃酮純化工藝條件優化[J].食品科學,2015(4):68-73.

[12]羅璽,唐慶九,張勁松,等. 靈芝多糖樹脂法脫色工藝優化[J].食品科學,2011,32(16):5-10.

[13]肖麗霞,于洪濤,胡曉松. 香菇多糖的樹脂脫色工藝研究[J]. 食品與機械,2011,27(6):241-244.

[14]李國平,陳劍鋒,許明塔,等. 高純度京尼平苷的分離純化[J]. 現代化工,2007,S2:386-389.

[15]謝鍵泓,曾彥雯,梁華正,等. 堿水解梔子苷大孔樹脂分離純化京尼平苷酸[J].食品科技,2011,(11):226-229.

[16]曾超珍,劉志祥,韓磊. 大孔樹脂法純化柑橘皮中的橙皮甙及其油脂抗氧化活性研究[J].中國食品學報,2012,12(3):119-124.

[17]劉長江,欒云峰,王菲,等. 大孔吸附樹脂分離純化軟棗獼猴桃總黃酮[J].食品科學,2011,32(12):145-148.

[18]曹慧,陳曉青,肖建波,等. A型吸附樹脂分離純化杜仲中京尼平甙酸[J].離子交換與吸附,2005,21(5):415-423.

Purification and preparation of geniposidic acid by macroporous resin

SHANG Feng1,YIN Sheng1,2,XIAO Xiao1,WANG Cheng-tao1,2,*,WEN Yan-jun3

(1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing 100048,China;2.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Technology and Business University(BTBU),Beijing 100048,China;3.Henan Zhongda Biological Engineering Co.,Ltd.,Zhengzhou 451162,China)

The factors and process conditions on purification and preparation of geniposidic acid from alkaline hydrolyzate of exhausted solution of gardenia yellow by macroporous resin were studied. The optimum technology of the preparation of GPA was found according to the decolorization and adsorption-desorption performance of GPA by different resins. The results showed that DA201 weak polar resins had the best decolorization performance and poor absorption of the GPA;DA201C non-polar resin had higer adsorption rate and desorption rate,reaching 88.7% and 98%,respectively. When the amount of resin was 1 g/25 mL 10 mg/mL of GPA crude liquid,pH 4.0,25 ℃,120 r/min,decoloration time 6 h,the decolorization rate reached 85.9%,GPA retention rate reached 92.3%.The optimum conditions for DA201C resin adsorption of GPA were as follows:destaining solution concentration 10 mg/mL,pH 3.0,adsorption velocity 1 BV/h,sample volume 7.2 BV. After eluting with 25% ethanol and drying the eluent,a purity of GPA of 95.1% and a recovery rate of 86.2% were obtained. It showed that DA201 resin was suitable for decolorization and DA201C resin was suitable for adsorption-desorption of GPA on purification and preparation.

Geniposidic;Geniposidic acid;Macroporous resin;Purification;Decolorization

2015-06-03

商鋒(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：天然食用色素生物制備技術，E-mail:yuexifenghe@126.com。

王成濤(1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：wct5566@163.com。

北京市科技計劃項目(Z151100001215008)；國家高新技術研究發展計劃(863計劃)項目(2012AA021502)；北京市屬高等學校食品科學創新團隊項目(IDHT20130506)資助。

TS201.1

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000