DNA條形碼序列對藥食兩用品花椒的品種鑒定

王　福,閆珂巍,梅國榮,盧俊宇,潘歡歡,陳鴻平,陳　林,何玉瓊,劉友平

(成都中醫藥大學藥學院,成都 611137)

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DNA條形碼序列對藥食兩用品花椒的品種鑒定

王福,閆珂巍,梅國榮,盧俊宇,潘歡歡,陳鴻平,陳林,何玉瓊,劉友平*

(成都中醫藥大學藥學院,成都 611137)

目的:利用DNA條形碼鑒定技術,快速、準確的鑒別中藥花椒,區別中藥花椒及其市售香料花椒的品種來源差異。方法:采用植物DNA試劑盒提取花椒及其混偽品基因組DNA,對全部收集樣品的ITS2序列進行擴增和測序,計算物種種間種內Kimura2-parameter(K2P)遺傳距離。采用Blast、最近距離法及基于ITS2序列構建Neighbor-joining(NJ)系統聚類樹進行鑒別分析。結果:中藥花椒及香料花椒的序列長度為224～227 bp,中藥花椒種間平均K2P遺傳距離明顯大于香料花椒種內平均K2P遺傳距離;ITS2分子系統樹顯示,中藥花椒及香料花椒均聚為一單系分枝。結論:ITS2序列作為DNA條形碼能準確鑒別中藥花椒及其香料花椒,為中藥花椒及其香料花椒的鑒別提供了依據。

中藥花椒,ITS2,psbA-trnH,分子鑒定,DNA條形碼

中藥花椒為蕓香科植物青椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)或花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)的干燥成熟果皮[1],具有溫中止痛,殺蟲止癢之功效。中藥花椒的兩基源植物花椒與青椒即可以藥用,也被廣泛用作調味品食用。市售香料青花椒植物名為竹葉花椒(Z.armatum),被地方標準收載作為藥用(廣西)[2],其商品名也叫青椒。花椒在市場上流通最廣,其次為竹葉花椒,青椒(Z.schinifolium)則主要以野生狀態分布,資源稀少。市場調查發現,竹葉花椒商品名與中藥花椒基源種青椒異物同名,易被誤用為花椒藥材;另外,野花椒(Z.simulans)與簕欓花椒(Z.avicennae)隨著花椒市場價格的高低波動,在市場中常常作為香料流通,商品名統為小椒,常被作為花椒藥材的混偽品。花椒藥材與香料花椒品種來源較為復雜,且隨著年份的變化而變化,因此分辨可藥用及可食用香料花椒品種,對中藥花椒的臨床安全以及香料花椒市場的規范具有重要作用。

近年來,在中藥鑒定方面,陳士林[3]等通過大尺度取樣和大量的DNA條形碼序列篩選,首次提出以ITS2序列為核心序列,psbA-trnH為補充的藥用植物DNA條形碼鑒定體系,姚輝[4]等提出ITS2序列可作為植物物種鑒定的通用條形碼。ITS2序列的鑒別能力已在多種藥用植物和藥材的鑒定中得到了驗證和應用[5-9]。在中藥花椒鑒定方面,沈潔等[10]采用克隆測序ITS序列的方式對7個不同居群的花椒和野花椒、竹葉花椒進行了鑒定,但缺少對青椒及簕欓花椒的研究;候典云等[11]應用ITS/ITS2序列對中藥花椒藥材進行了鑒定,而缺乏對市售香料花椒的鑒定。中藥花椒及其香料花椒在市場上主要以干燥成熟果皮流通,因此對花椒干燥品的DNA條形碼鑒定對中藥花椒及香料花椒的快速鑒別具有重要意義。同時由于ITS序列在部分種屬中序列獲得率偏低[12-13],故本研究主要選用核基因ITS2片段,通過對中藥花椒及其香料花椒31份個體進行基因片段擴增、測序、并應用DNA條形碼技術進行分析,以期為中藥花椒及其香料花椒干燥品的準確鑒定提供依據。

表1　實驗所用樣本信息

注:“-”代表沒有樣品采集信息。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗采集樣品信息見表1,含花椒屬植物31個,中藥花椒有16份,其中花椒(Z.bungeanum)13份,青椒(Z.schinifolium)3份;香料花椒竹葉花椒(Z.armatum)11份;其他品種4份,野花椒(Z.simulans)3份,簕欓花椒(Z.avicennae)1份。GenBank下載序列9條,含青椒(Z.schinifolium)6條,野花椒(Z.simulans)2條,簕欓花椒(Z.avicennae)1條。實驗所用樣品均為干燥成熟果皮,由成都中醫藥大學陳新教授鑒定,憑證標本于常溫保存于成都中醫藥大學標本館。

植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,China);2×Taq PCR MasterMix(Tiangen Biotech Co.,China);引物由上海生工(SangonCo.,China)合成。

Retsch MM400球磨儀德國萊馳公司;PTC200PCR儀美國BIO-Rad公司;GelDox XR凝膠成像系統美國BIO-Rad公司;DYY-8C電泳儀北京六一儀器廠;BI3730XL測序儀美國Applied Bio-systems 公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品DNA 的提取、擴增和測序用改良DNA提取試劑盒提取樣品DNA,水浴時間改為2 h、DNA沉淀劑為-20 ℃冷凍異丙醇[11],其它步驟均按試劑盒提取方法;ITS2序列擴增使用DNA條形碼通用引物。全部樣品ITS2序列的PCR反應條件及擴增程序參考陳士林[14]等研究。

1.2.2數據處理測序所得的峰圖采用CodonCodeAligner V5.0軟件(CodonCode Co.,USA)對序列峰圖進行校對拼接,去除引物區和低質量的序列,利用軟件MEGA6計算物種種內種間Kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離,構建鄰接(Neighbor-joining,NJ)系統發育樹,利用Bootstrap(BS)(1000次重復)檢驗各分支的支持率。

2　結果與分析

2.1中藥花椒及香料花椒種內、種間變異分析

花椒種內不同來源樣品的ITS2序列長度為224 bp,分為3個單倍型(表1),單倍型B1有3條序列全部與HM851462相同,單倍型B2有5條序列全部與HG002512相同,單倍型B3有5條序列與DQ016542相同,花椒種內變異位點數為7;青椒種內不同來源的ITS2序列長度為224 bp,序列種內無變異,同為單倍型C1。花椒種內最大遺傳距離為0.029,種內平均遺傳距離為0.004;青椒種內遺傳距離為0;竹葉花椒種內不同來源的ITS2序列長度為227 bp,單倍型有二種,單倍型A1與JX393932相同,單倍型A2與DQ016546相同;野花椒種內不同來源的ITS2序列長度為224 bp,二種單倍型;簕欓花椒種內不同來源的ITS2序列長度為224 bp,同為二種單倍型。中藥花椒及其香料花椒ITS2序列信息見表2。

花椒ITS2序列種間最小K2P為0.024,青椒ITS2序列種間最小K2P為0.016,均遠大于花椒種內最大K2P距離0.019及青椒種內最大的K2P距離0。香料花椒竹葉花椒、野花椒及簕欓花椒的種內最大K2P距離均小于各物種種間最小K2P距離,中藥花椒及其香料花椒ITS2序列K2P遺傳距離見表3。

表2　中藥花椒及其香料花椒ITS2序列信息表

表3　中藥花椒及其香料花椒ITS2序列K2P遺傳距離

2.2中藥花椒及香料花椒的鑒別

基于最小距離法鑒定結果表明,單一ITS2序列對花椒、青椒、簕欓花椒和竹葉花椒的物種鑒定率為100%。但對同屬野花椒樣品(DQ016545)不能成功鑒定,鑒定成功率為93.0%;同時利用“中藥材DNA條形碼鑒定系統”以及BLAST搜索鑒定均證實該野花椒樣品不能成功鑒定。基于ITS2序列構建的NJ系統聚類樹見圖1,結果表明,花椒、青椒、竹葉花椒、簕欓花椒與野花椒各自聚為一支,可以明顯區分,其中花椒與野花椒、竹葉花椒的親緣關系較為密切,花椒藥材的兩個基源物種花椒和青椒的親緣關系則相對較遠,簕欓花椒與青椒親緣關系較近。

圖1　基于ITS2序列構建的中藥花椒及其香料花椒的NJ樹Fig.1　The NJ tree of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers

3　結論與討論

針對本實驗花椒屬5個物種的ITS2序列可以鑒別所有花椒屬植物,但采集于山東沂蒙山野花椒樣品除外。同時基于ITS2序列的BLAST搜索、K2P遺傳距離證實采集于山東沂蒙山野花椒ITS2序列不能準確鑒別到種,誤鑒定為花椒(GQ434824),而采集于廣東乳源的野花椒(HM851466)ITS2序列可以準確鑒別到種。因此,在查閱文獻的基礎上[15-16],對所有野花椒樣品的psbA-trnH序列進行擴增與測序,結果證實psbA-trnH可成功鑒別該野花椒樣品。即ITS2與psbA-trnH混合序列可以成功鑒別實驗所用中藥花椒及其香料花椒樣品,研究結果與陳士林[17]提出以ITS2序列為核心序列,psbA-trnH為補充的藥用植物DNA條形碼鑒定體系相一致。

花椒及其混偽品樣品K2P遺傳距離分析與NJ系統聚類樹結果顯示,花椒與野花椒、竹葉花椒的親緣關系較為密切,花椒藥材的兩個基源物種花椒和青椒的親緣關系則相對較遠,簕欓花椒與青椒親緣關系較近。青椒、花椒及其竹葉花椒皆為藥食兩用品,而市場上的野花椒及其簕欓花椒則常作為香料或中藥花椒的混偽品流通,其科學性有待考證。李惠勇[18]對藥典收載花椒藥材品種花椒和青椒進行了本草學記載、以及生藥學、化學成分、藥效學等幾方面的研究,結果顯示均存在較大差異,故建議將花椒藥材兩基源物種花椒和青椒分開使用。

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Authentication of homology of medicine and food Huajiao by DNA barcoding sequences

WANG Fu,YAN Ke-wei,Mei GUO-rong,LU Jun-yu,PAN Huan-huan,CHEN Hong-ping,CHEN Lin,HE Yu-qiong,LIU You-ping*

(College of pharmacy,Cheng Du University of TCM,ChengDu 611137,China)

Objective:To authenticate Pericarpium Zanthoxyli and investigate the origin of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers accurately,DNA barcoding technique was used. Methods:Total genomic DNA was isolated from Pericarpium Zanthoxyli and its adulterants using the plant DNA kit. The ITS2 sequences of all samples were amplified and sequenced. The Kimura 2-parameter(K2P)distances were calculated. Identification analyses were performed using Blast,nearest distance and Neighbor-joining(NJ)methods. Results:The lengths of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers were between 224～227 bp. Interspecific distances of Pericarpium Zanthoxyli was bigger than the intraspecific distances of commercial spice peppers. The NJ tree showed that every breeds had a single branches. Conclusion:The sequence of ITS2 was efficient barcode for the authentication of Pericarpium Zanthoxyli and other spices,and provided according for the identification of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers.

Pericarpium Zanthoxyli;ITS2;psbA-trnH;molecular identification;DNA barcode

2015-03-23

王福(1988-)，碩士，從事中藥化學與質量標準研究， E-mail:wangfunny00@163.com。

劉友平(1964-)，研究員，博士生導師，從事中藥質量標準化及藥效物質基礎研究， E-mail:lyp11cdutcm.edu.cn。

2015版《中國藥典》增修訂項目。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000