新疆賽買提杏采后主要病原真菌的分離及鑒定

吳思雅,阿衣木古麗·艾賽提,鄭燦龍,朱　璇

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

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新疆賽買提杏采后主要病原真菌的分離及鑒定

吳思雅,阿衣木古麗·艾賽提,鄭燦龍,朱璇*

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

本文采用新疆賽買提杏為材料,常規組織分離法得到引起采后腐爛的主要病原真菌有3類,通過形態學及rDNA-ITS序列克隆分析的方法對其進行鑒定。研究發現:引起新疆賽買提杏采后腐爛的主要病原菌有3類,分別為交孢鏈格孢(Alternariaalternata)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)和皮落青霉(Penicilliumcrustosum)。本研究可為杏貯藏保鮮及病害的防治提供理論依據和技術指導。

賽買提杏,采后病害,病原菌鑒定,形態特征,ITS

杏(Prunusarmeniacal)屬薔薇科(Rosaceae),李屬(Prunoideae),屬于呼吸躍變型果實。據2014年新疆統計年鑒所示[1],新疆杏的種植面積約13.58 hm2,產量達140.69萬t,占全疆水果總面積的18.70%、總產量的23.53%。賽買提杏營養豐富,既可以制干也可以鮮食,深受廣大消費者喜愛,是新疆杏樹的主摘品種之一,但是杏后熟期短,果實采后易腐爛變質,造成嚴重的經濟損失。杏采后腐爛損失主要是由病原微生物侵染引起的[2]。通過形態學初步鑒定認為,引起杏采后腐爛的病原菌主要有鏈格孢(Alternariasp.)、青霉(Penicilliumsp.)、根霉(Rhizopussp.)。近年來,隨著分子生物學的發展,利用PCR擴增病原菌核糖體ITS(Internal Transcribed Spacer)基因區段進行病原菌鑒定技術廣泛應用于棗、柑橘、甜瓜、櫻桃、香梨等園藝產品采后病原菌的鑒定中[3-6],此方法從分子水平上對病原菌進行了準確鑒定,為控制園藝產品采后病害提供理論依據。目前,國內外對杏采后病害的研究主要集中在防治方法的探索上,對引起杏果實采后病害的主要病原真菌的鑒定還未見相關報道,本研究采用形態學和分子生物學技術對新疆賽買提杏病原菌進行鑒定,為病害的進一步防治提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

PDA培養基:稱取200 g馬鈴薯,洗凈去皮切成小塊,加入1000 mL水煮沸30 min,紗布過濾,再加葡萄糖20 g,瓊脂20 g,121 ℃,滅菌15 min。

超凈工作臺蘇州凈化設備廠;YXQ-SG46-280S高壓滅菌鍋上海博訊實業有限公司;生化培養箱江蘇南通五金電器廠;XSP-2CA顯微鏡廈門Motic實業集團有限公司;型號Biometra Tprofessional PCR儀。

1.2實驗方法

1.2.1新疆賽買提杏采后病原菌的分離純化參考方中達方法[7],采集典型發病的賽買提杏果實,切取病健交界處組織放置于70%酒精溶液中浸泡約30 s,以殺滅所帶雜菌,然后置于無菌水中沖洗3次,將沖洗干凈的組織移置到PDA培養基上,于26 ℃恒溫培養。待菌落生長到1 cm時用接種針刮取菌的邊緣,移植在新的培養基上,劃線培養,直到形成單一菌種。

采用稀釋純化法,菌落平板內加20 mL滅菌水,輕輕搖晃,倒入滅菌燒杯內,加30 mL滅菌水稀釋,取一滴在顯微鏡下觀察,不斷稀釋到每一小滴懸液中只有一個孢子,用滅菌水沖洗到培養基上,靜置10 min后,倒去多余的懸液,放在適合的條件下培養。

1.2.2新疆賽買提杏采后病原菌的鑒定

1.2.2.1病原菌的形態學鑒定根據病原菌在杏果實上的發病癥狀及病原菌在PDA上菌落特征,菌絲形態,分生孢子形態,大小和數量,分生孢子梗形態特征,厚垣孢子的有無、形態和大小等,參照魏景超[8]《真菌鑒定手冊》對病原菌進行形態學鑒定。

1.2.3病原菌的分子生物學鑒定

1.2.3.1病原菌DNA的提取按照上海生物工程Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8259)的說明提取。

1.2.3.2rDNA-ITS序列的擴增根據姚子鵬等[9]的報道,擴增ITS區(以ITS1:5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′和 ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′為引物)的 rDNA 序列,反應體系 50 μL(5 μL PCR buffer(10×PCR buffer),5 μL dNTPs(5.0 mmol/L)(全式金),1 μL模板DNA,上下游引物各1 μL,0.25 μL Taq(全式金),加dd H2O至50 μL。PCR程序:94 ℃預變性5 min后,30個循環包括94 ℃ 50 s,51 ℃ 50 s、72 ℃ 2 min,72 ℃延伸10 min。反應完成后,-20 ℃保存備用,0.8%瓊脂糖電泳檢測。將PCR產物純化后直接測序(測序由上海生物工程有限公司完成)。將獲得的基因序列在NCBI數據庫進行BLAST。

2　結果與討論

2.1新疆賽買提杏采后病原菌形態學鑒定結果

2.1.1病原菌A形態學鑒定病原菌A在杏果實上的發病癥狀為病斑較硬,略凹陷,表面有褐色或者黑色孢子霉層。菌株在PDA平板上,初為灰白色,氣生菌絲薄層絮狀,產孢后為淺綠色至褐色,有明顯的輪紋,培養一周的菌落直徑為69～86.2 mm。分生孢子串生,孢子倒棍型或長卵型,具有柱狀的喙。分生孢子梗單生,分枝或不分枝,淺褐色,有隔2～7個,長21.5～59.2μm。參照魏景超[8]《真菌鑒定手冊》初步鑒定為鏈格孢屬(Alternariasp.)。

圖1　病原真菌A的形態及培養性狀Fig.1　Form and culture character of pathogenic fungi A

2.1.2病原菌B形態學鑒定菌株B可在果實表面或內部發病,先形成褐色水漬斑,之后生出白色菌絲,然后長出青色或綠色霉層,最后導致全果腐爛。病原菌菌落呈藍綠色;菌絲有隔單核,分生孢子梗直立,頂端1至多次分枝呈掃帚狀,分枝上產生3輪不對稱的瓶狀小梗,其頂端著生成串的分生孢子,球形,呈念珠狀,一般成串相連,孢子直徑2～3 μm。參照魏景超[8]《真菌鑒定手冊》初步鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.)。

圖 2　 病原真菌B的形態及培養性狀Fig.2　Form and culture character of pathogenic fungi C

2.1.3病原菌C形態學鑒定菌株C在杏果實上的發病癥狀最初出現茶褐色小斑點后迅速擴大,鄰近果實也極易發病,1～2 d后,病部變軟呈水浸果實,全面發生大量棉絮狀菌絲,有光澤的長條形霉,接著產生黑色孢子。在培養基上培養病原菌,菌絲生長迅速,3 d就能充滿培養皿整個空間菌落黑灰色;有發達的假根和匍匐枝,菌絲無隔,孢囊梗較長,自假根伸出單根而不分枝,末端突入孢囊內與孢囊相接,1～10枝叢生于假根上;孢子囊為球形,孢囊孢子形狀不規則,孢子大小10～20 μm,參照魏景超[8]《真菌鑒定手冊》初步鑒定為根霉屬(Rhizopussp.)。

圖3　病原真菌B的形態及培養性狀Fig.3　Form and culture character of pathogenic fungi C

2.2新疆賽買提杏采后病原菌rDNA-ITS序列分析

為了進一步確定三種菌的種名,采用rDNA-ITS[10]分子鑒定法對這三種菌株進行分析。經瓊脂糖凝膠電泳檢測,分離得到的3種真菌的PCR反應體系產物均為單一條帶,如圖4所示。

圖4　病原菌的ITS擴增電泳圖Fig.4　Amplification Electrophoretogram of fungi’s ITS注:M為DNA Marker;1～3分別為A～C病原真菌的ITS擴增產物。

以病原真菌DNA為模板,經通用引物擴增而得到長度約為540 bp和750 bp左右的 rDNA-ITS序列。把所得到序列提交到GeneBank數據庫,進行BLAST比較,菌株A的ITS序列與Alternariaalternata(JF835807.1)同源性為99%,菌株B的ITS序列與P.crustosum(DQ875021.1)同源性99%,菌株C的ITS序列與Rhizopusstolonifer(JX241668.1)同源性為100%。

2.3討論

果蔬在采后貯藏期間由于病原真菌侵染而造成的腐爛是導致其損失的主要原因。傳統病原菌的鑒定方法主要根據形態特征、分生孢子梗及菌落形態來進行分類,然而由于許多病原菌形態特征難以獲得及其培養性狀的可變性,此方法具有一定的局限性,存在著需要經驗,耗時較長等問題。與傳統的形態學鑒定相比,利用PCR擴增病原菌rDNA-ITS基因序列在病原真菌的鑒定中具有簡便快捷,準確性高等優點。

本實驗通過傳統形態學和分子生物學相結合的方法,從發病的杏果實中分離鑒定出引起賽買提杏果實采后病害的三種菌株,分別為A.alternata、P.crustosum和R.stolonifer。近年來,從貯藏的杏果實中分離出A.alternata和R.stolonifer已有資料報道,賈盼盼[2]等的研究中指出A.alternata、P.expansum和R.stolonifer是引起新疆杏果實采后病害的主要病原菌;張瑾等[11]發現引起蘭州大接杏采后病害的病原菌主要有A.alternata、常現青霉(Penicilliumfrequentans)、黑根霉(Rhizopusnigricans)等;而P.crustosum作為杏采后致病菌還未見報道,但Wang等[12]在蘋果曾分離出P.crustosum。研究表明,不同年份不同地區不同品種及不同栽培和貯藏條件的果實,引起其采后病害的病原菌種類也存在一定差異[13-14]。本研究從發病的賽買提杏果實分離鑒定出P.crustosum也反映出這一特點。對引起水果采后腐爛的病原菌進行準確鑒定是進行病害研究的前提條件,而且對有效開展病害防治工作具有重要意義。

3　結論

以新疆賽買提杏為主要原料,對其采后主要病原真菌的鑒定,得出以下結論:

通過形態學和分子生物學相結合的方法,從發病的杏果實中分離鑒定出引起賽買提杏果實采后病害的三種菌株,分別為A.alternata、R.stolonifer和P.crustosum,但是由于病原果實取材范圍較窄,若想全面地揭示引起杏果實采后病原菌的種類和優勢菌株等問題,需要進一步擴大采樣范圍,且隨著分子生物學的迅猛發展,對杏果實主要病原菌更深入的研究將成為可能,對延長果實貯藏保鮮具有重要意義。

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Identification of main pathogenic fungus from post-harvest “Saimaiti”apricot fruits

WU Si-ya,Ayimuguli.aisaiti,ZHENG Can-long,ZHU Xuan*

(College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

Xin Jiang “Saimaiti” apricots were taken as the experimental material in this paper. Three pathogenic fungus which was obtained from the decay apricots were identified by morphological method and rDNA-ITS sequence analysis. The result showed thatAlternariaalternate,Penicilliumcrustosum,Rhizopusstoloniferawere three main post-harvest fungus of apricot fruits. The research may provide theoretical and technology guide for prolong storage period and disease control of apricot fruits.

Apricot;diseases;identification of pathogens;morphological characteristics;ITS

2015-05-13

吳思雅(1993-),女，碩士,主要研究方向：果蔬貯藏與保鮮，E-mail: wsy930218@sina.com。

朱璇(1971-)，女，博士，教授，主要研究方向：果蔬貯藏與保鮮，E-mail：zx9927@126.com。

國家自然科學基金項目(31460414)；公益性行業(農業)科研專項(201303075)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000