超聲波-陰/陽離子表面活性劑協(xié)同提取茅巖莓總黃酮的工藝研究

朱　欣,郭紅英,譚興和,于瀟杰,張　喻,王　鋒,鄧潔紅

(湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,湖南長沙 410000)

?

超聲波-陰/陽離子表面活性劑協(xié)同提取茅巖莓總黃酮的工藝研究

朱欣,郭紅英,譚興和*,于瀟杰,張喻,王鋒,鄧潔紅

(湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,湖南長沙 410000)

優(yōu)化超聲波協(xié)同陰/陽離子表面活性劑提取茅巖莓總黃酮的工藝,通過單因素實驗,考察表面活性劑濃度、陰/陽離子表面活性劑摩爾質量比、提取溫度、乙醇濃度和提取時間對茅巖莓總黃酮得率的影響。在此基礎上,固定陰/陽離子表面活性劑摩爾質量比為40∶1(SDS∶CTAB)、料液比1∶20(g/mL)和提取溫度60 ℃,采用響應面實驗考察表面活性劑濃度、乙醇濃度和提取時間對茅巖莓總黃酮得率的影響。結果表明最佳提取工藝參數(shù)為:表面活性劑濃度1.1%、乙醇濃度40%、提取時間57 min,此條件下茅巖莓總黃酮得率為23.27%,與預測理論值23.45%相差較小,說明該實驗方法可行。

茅巖莓,總黃酮,超聲波,表面活性劑,響應面優(yōu)化法

茅巖莓(Ampelopsisgrossedentata),學名顯齒蛇葡萄,屬葡萄科(VitaceaeMiehx)蛇葡萄屬(Ampelopsis)藤本植物,主要分布在江南各省,生長環(huán)境一般在海拔400～1300 m之間[1]。有研究表明,茅巖莓中黃酮含量高達30%,其中以二氫楊梅素為主,含量在20%左右[2]。黃酮類化合物是植物長期抵抗環(huán)境阻力而形成的一大類次級代謝產(chǎn)物[3],是一種高效的生物抗氧化劑,在植物整個生長代謝過程中起重大作用[4]。現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn),黃酮類物質具有抗真菌[5]、抗細菌[6]、抗癌[7]、抗輻射[8-9]、調節(jié)人體內分泌系統(tǒng)[10]和心腦血管系統(tǒng)[11]等功效。目前用超聲波輔助有機溶劑提取黃酮類物質的研究有很多[12-13],應用單一表面活性劑提取黃酮類物質的研究也有報道[14-15],但應用超聲波協(xié)同陰/陽離子表面活性劑復配體系提取茅巖莓總黃酮的研究很少,本實驗將采用超聲波輔助陰/陽離子表面活性劑復配體系提取茅巖莓總黃酮,借助實驗設計軟件Design Expert對各主要影響因子(表面活性劑濃度、提取時間、乙醇濃度)的單一和交互作用進行研究,得出超聲波協(xié)同陰/陽離子表面活性劑復配體系提取茅巖莓總黃酮的最佳提取工藝。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

茅巖莓(湖南張家界),經(jīng)干燥,粉碎,過40目篩得粗制品,干燥避光保存;二氫楊梅素(化學標準品)成都曼斯特生物科技有限公司;無水乙醇、六水三氯化鋁、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、十六烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、溴代十六烷基吡啶(以上均為分析純試劑)、吐溫-20、吐溫-80、OP-10(以上三種為化學純試劑)國藥集團化學試劑有限公司。

超聲波清洗器KQ-5200DE型,昆山市超聲儀器有限公司;離心機TGW16型,長沙英泰儀器有限公司;紫外可見分光光度儀UV-2450型,日本島津公司;電子分析天平ATX224型,日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制準確稱取二氫楊梅素標準品3.0 mg,用體積分數(shù)95%乙醇溶解,定容到25 mL 容量瓶中,搖勻,得0.12 mg/mL二氫楊梅素標準溶液母液。

1.2.2標準曲線的繪制準確吸取0.12 mg/mL二氫楊梅素標準溶液母液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,分別置于7支25 mL容量瓶中,加3 mL質量分數(shù)為5%的AlCl3溶液,用95%的乙醇定容,配制成濃度分別為0.0000、0.0024、0.0048、0.0072、0.0096、0.0120、0.0144 mg/mL的二氫楊梅素標準溶液,靜置40 min,然后倒入比色皿中,在296 nm 波長處測定吸光度。

1.2.3茅巖莓總黃酮含量的測定精確稱取一定量茅巖莓粉末,置于具塞磨口試管中,加入50 mL提取液,在不同條件下進行超聲波-表面活性劑協(xié)同提取,之后10000 r/min離心5 min,過濾得澄清液。準確吸取20 μL澄清液置于25 mL容量瓶中,加3 mL質量分數(shù)為5%的AlCl3溶液,用95%乙醇定容至刻度,靜置40 min,倒入比色皿中,在波長296 nm處測定其吸光度,根據(jù)標準曲線,計算茅巖莓總黃酮得率(Y):Y=C×α×V/W×100%,式中,C-提取液中總黃酮的質量濃度,mg/mL;α-稀釋倍數(shù)(1250倍);V-提取液體積(50 mL);W-茅巖莓粉末質量,mg。

1.2.4單因素實驗

1.2.4.1表面活性劑種類對茅巖莓總黃酮得率的影響準確稱取8份茅巖莓粉末,每份2.500 g,分別以濃度為0.3%(用30%乙醇溶解)的十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、溴代十六烷基吡啶、吐溫-20、吐溫-80、OP-10的溶液作為提取劑,在超聲頻率40 kHz、超聲功率200 W、提取溫度50 ℃、提取時間30 min、料液比1∶20(g/mL)的條件下,提取1次,按1.2.3節(jié)的方法,計算茅巖莓總黃酮得率,比較、篩選出總黃酮得率最高的表面活性劑。

1.2.4.2陰/陽離子表面活性劑復配比例對茅巖莓總黃酮得率的影響選取總黃酮得率最高的兩種陰陽離子表面活性劑在活性劑總含量為0.3%(用30%乙醇溶解)的情況下按摩爾質量比(陰∶陽)10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的比例配制成提取液,按1.2.3節(jié)的方法,計算每組的總黃酮得率,比較、篩選出總黃酮得率最高的復配比例。

1.2.4.3復配體系表面活性劑濃度對茅巖莓總黃酮得率的影響按照1.2.3節(jié)的方法,選取料液比1∶20(g/mL)、乙醇濃度30%、提取溫度50 ℃、提取時間30 min,分別考察表面活性劑濃度為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%時對茅巖莓總黃酮得率的影響。

1.2.4.4料液比對茅巖莓總黃酮得率的影響按照1.2.3節(jié)的方法,選取表面活性劑濃度0.3%、乙醇濃度30%、提取溫度50 ℃、提取時間30 min,分別考察料液比(g/mL)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60時對茅巖莓總黃酮得率的影響。

1.2.4.5提取溫度對茅巖莓總黃酮得率的影響按照1.2.3節(jié)的方法,選取表面活性劑濃度0.3%、料液比1∶20(g/mL)、乙醇濃度30%、提取時間30 min,分別考察提取溫度為30、40、50、60、70、80 ℃時對茅巖莓總黃酮的率的影響。

1.2.4.6乙醇濃度對茅巖莓總黃酮得率的影響按照1.2.3節(jié)的方法,選取表面活性劑濃度0.3%、料液比1∶20(g/mL)、提取溫度50 ℃、提取時間30 min,分別考察乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%和80%時對茅巖莓總黃酮得率的影響。

1.2.4.7提取時間對茅巖莓總黃酮得率的影響按照1.2.3節(jié)的方法,選取表面活性劑濃度0.3%、料液比1∶20(g/mL)、乙醇濃度30%、提取溫度50 ℃,分別考察提取時間為20、40、60、80、100、120 min時對茅巖莓總黃酮得率的影響。

1.2.5響應面設計在單因素實驗基礎上,確定陰/陽離子表面活性劑比例、料液比和提取溫度分別為SDS∶CTAB=40∶1、1∶20和60 ℃,以茅巖莓總黃酮得率為響應值,以表面活性劑濃度(A)、提取時間(B)和乙醇濃度(C)為自變量,設計響應面實驗優(yōu)化茅巖莓總黃酮的提取工藝,確定最佳的提取工藝參數(shù),因素編碼及各水平見表1。

表1　響應面法分析因素及水平

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

單因素實驗數(shù)據(jù)導入Excel 2012制圖,為探討不同因素對茅巖莓總黃酮得率的影響,將表1中的響應面設計導入Design Expert 8.0.6,以其設計結果為基準設計實驗,實驗結果再導入Design Expert 8.0.6進行各項數(shù)據(jù)分析,確定最佳的茅巖莓總黃酮提取工藝。

2　結果與分析

2.1標準曲線

以吸光度(A)為縱坐標、二氫楊梅素濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線,見圖1。

圖1　二氫楊梅素標準曲線Fig.1　Standard curve of dihydromyricetin

回歸標準曲線為:A=55.134C-0.0001R2=0.9971。式中A-二氫楊梅素的吸光度;C-二氫楊梅素的質量濃度,mg/mL。

2.2單因素實驗

2.2.1表面活性劑種類對茅巖莓總黃酮得率的影響由表2可知,在相同條件下,用陰離子表面活性劑提取的總黃酮得率比用陽離子和非離子表面活性劑提取的總黃酮得率要高,而在陰離子表面活性劑中,以SDS提取的總黃酮得率最高,達到14.50%,比空白對照組提高了4.06%,這可能是因為陰離子表面活性在溶液中形成的締合結構能更好地與黃酮類物質結合,從而增強了其提取效果[16]。而陰/陽離子復配體系的總黃酮得率又普遍高于任何單一表面活性劑的總黃酮得率,達到15.24%,這可能是由于正、負電荷之間的吸引力使陰陽離子表面活性劑更容易聚集形成膠團,從而提高了其表面活性[17]。

表2　不同表面活性劑對茅巖莓總黃酮得率的影響

注:“-”表示未檢出。

2.2.2陰/陽離子表面活性劑復配比例對茅巖莓總黃酮得率的影響由圖2可知,在陰/陽離子表面活性劑比例10∶1與40∶1之間,隨著比例的增大,總黃酮得率不斷增大,在40∶1時總黃酮得率達到最大值18.85%,而當陰/陽離子表面活性劑比例超過40∶1時,總黃酮得率開始下降,同時伴有絮狀沉淀出現(xiàn),這可能是因為提取液中陰/陽離子表面活性劑比例失衡,導致提取液中膠束數(shù)量減少,表面活性劑活性降低。

2.2.3復配體系表面活性劑濃度對茅巖莓總黃酮得率的影響由圖3可知,在表面活性劑濃度0.4%與1.0%之間,隨著濃度的增加,總黃酮得率不斷提高,在濃度達到1.0%時,總黃酮得率達到最大值18.50%,當表面活性劑濃度超過1.0%時,總黃酮得率反而出現(xiàn)下降,可能是因為太高的表面活性劑濃度不利于提取溶液中膠束的形成,從而導致總黃酮得率下降。

圖3　表面活性劑濃度對茅巖莓總黃酮得率的影響Fig.3　Effects of different surfactant concentration on the yield of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata

2.2.4料液比對茅巖莓總黃酮得率的影響由圖4可知,隨著料液比的增加,茅巖莓總黃酮得率不斷上升,當料液比超過1∶20以后,總黃酮得率的增幅不明顯,從節(jié)能和提高效率方面考慮,選取料液比1∶20進行后續(xù)實驗。

圖4　料液比對茅巖莓總黃酮得率的影響Fig.4　Effects of different ratio of material to solvent on the yield of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata

2.2.5提取溫度對茅巖莓總黃酮得率的影響由圖5可知,在提取溫度30 ℃與60 ℃之間,隨著溫度的升高,總黃酮得率不斷增大,當提取溫度達到60 ℃時,總黃酮得率達到最高19.46%,而提取溫度超過60 ℃后,總黃酮得率呈下降趨勢,原因可能是高溫引起部分黃酮類物質氧化,從而導致總黃酮得率下降。

圖5　提取溫度對茅巖莓總黃酮得率的影響Fig.5　Effects of different extraction temperature on the yield of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata

2.2.6乙醇濃度對茅巖莓總黃酮得率的影響由圖6可知,總黃酮得率隨乙醇濃度的提高大體呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,當乙醇濃度為50%時,總黃酮得率達到最高19.96%,而乙醇濃度超過50%之后,總黃酮得率隨著乙醇濃度的增加反而下降,是因為在高濃度乙醇溶液中,表面活性劑的溶解性降低,導致活性降低,總黃酮得率下降;也可能是因為大分子蛋白質難溶于高濃度乙醇,導致大分子蛋白質堵塞組織微孔,使黃酮類物質難以溶出,總黃酮得率下降。

圖6　乙醇濃度對茅巖莓總黃酮得率的影響Fig.6　Effects of different ethanol concentration on the yield of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata

2.2.7提取時間對茅巖莓總黃酮得率的影響由圖7可知,在提取時間20 min到60 min之間,總黃酮得率隨時間的推移不斷增大,在60 min時總黃酮得率達到最高16.47%,超過60 min之后,隨著提取時間的延長,總黃酮得率有所下降,可能是因為長時間的超聲波處理會破壞黃酮類物質,導致總黃酮得率下降。

圖7　提取時間對茅巖莓總黃酮得率的影響Fig.7　Effects of different extraction time on the yield of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata

2.3響應面實驗結果

經(jīng)回歸擬合后,得到以茅巖莓總黃酮得率(Y)為響應值的回歸方程:Y=22.67+1.45×A+0.65×B+0.21×C+0.23×A×B-0.78×A×C-1.81×B×C-2.77×A2-1.55×B2-0.50×C2

整體模型的p值小于0.001,證明該模型擬二次方程高度顯著,即該實驗方法可行,由表4可知,各因素一次項A表面活性劑濃度對響應值的影響極顯著,B提取時間對響應值的影響顯著,二次項A、B對響應值的影響極顯著,說明各實驗因素對響應值的影響不僅僅是線性的,二次項對響應值的影響也很大。交互項BC對響應值的影響極顯著?；貧w方程相關系數(shù)R2=0.9562,說明響應值(Y)的變化有95.62%來源于所選變量(即表面活性劑濃度、提取時間、乙醇濃度),所以,該方程能很好的描述各因素與響應值之間的關系,可以為確定茅巖莓總黃酮的最佳提取工藝提供參考。

表3　茅巖莓總黃酮提取響應面分析設計方案及結果

表4　茅巖莓總黃酮提取參數(shù)回歸分析結果

注:*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。

由圖8～10響應面立體圖可知,乙醇濃度和提取時間的交互作用對響應值的影響極顯著,而提取時間和表面活性劑濃度、乙醇濃度和表面活性劑濃度之間的交互作用對響應值影響不顯著。

圖8　提取時間和表面活性劑濃度的交互作用對總黃酮得率影響的響應面圖Fig.8　Response surface plot for effects of extraction time and surfactant concentration to the yield of total flavonoids

圖9　乙醇濃度和表面活性劑濃度的交互作用對總黃酮得率影響的響應面圖Fig.9　Response surface plot for effects of ethanol concentration and surfactant concentration to the yield of total flavonoids

圖10　乙醇濃度和提取時間的交互作用對總黃酮得率影響的響應面圖Fig.10　Response surface plot for effects of ethanol concentration and extraction time to the yield of total flavonoids

由圖7響應面立體圖可知,隨表面活性劑濃度的增大和提取時間的延長,總黃酮得率先增大后減小,且隨表面活性劑濃度的變化較大,這是因為大的表面活性劑濃度就意味著提取液中有更多的膠束數(shù)量,總黃酮得率隨之增大,但表面活性劑達到一定濃度之后,提取液中產(chǎn)生絮狀沉淀,表面活性劑活性降低,總黃酮得率下降,所以要選擇適宜的表面活性劑濃度。

由圖8響應面立體圖可知,隨著乙醇濃度和表面活性劑濃度的增大,總黃酮得率先升高后下降,但隨乙醇濃度升高的幅度不是很大,從經(jīng)濟角度考慮,盡量選擇低的乙醇濃度來提取。

由各響應面立體圖可知,響應值存在最大值。根據(jù)單因素實驗,并通過Design-Expert 8.0.6分析計算出最佳提取工藝:表面活性劑濃度1.09%、提取時間56.42 min、乙醇濃度40%,此條件下得出的理論總黃酮得率為23.45%,為了操作便利,將最佳工藝條件修正為:表面活性劑濃度1.1%、提取時間57 min、乙醇濃度40%,在此條件下重復實驗3次,得出的實際總黃酮得率為23.27%,與預測理論值23.45%相差不大,說明該方程與實際情況擬合性很好。

3　結論

利用超聲波輔助陰/陽離子表面活性劑復配體系對茅巖莓總黃酮進行提取,通過單因素實驗和響應面實驗對提取工藝進行優(yōu)化。擬合了表面活性劑濃度、提取時間、乙醇濃度對茅巖莓總黃酮提取得率的回歸模型,經(jīng)檢驗,該模型合理可靠,能很好的預測茅巖莓總黃酮的提取得率。通過該模型確定的最佳工藝條件為:表面活性劑濃度1.1%、提取時間57 min、乙醇濃度40%在此條件下重復3次,總黃酮得率為23.27%,與預測理論值23.45%相差較小。

同時,本實驗首次利用超聲波協(xié)同陰/陽離子表面活性劑復配體系對植物食源性黃酮進行提取。結果表明其茅巖莓總黃酮得率比單純利用超聲波輔助提取茅巖莓總黃酮提高了8.1%[]。但是,此實驗方法的不足之處在于殘留的表面活性劑會給后續(xù)總黃酮純化帶來不必要的麻煩,所以,如何除去表面活性劑或者消除其影響在今后還需要做進一步的研究。

[1]蘇素嬌. 顯齒蛇葡萄品質評價及其相關藥效學研究[D].福建中醫(yī)藥大學,2014.

[2]何桂霞. 茅巖莓活性成分的分離鑒定及藥理作用研究[D].湖南農(nóng)業(yè)大學,2004.

[3]Loverine P Taylor,Erich Grotewold. Flavonoids as developmental regulators[J]. Current Opinion in Plant Biology,2005,8(3):317-323.

[4]Brunetti Cecilia,Di Ferdinando Martina,Fini Alessio,et al. Flavonoids as antioxidants and developmental regulators:relative significance in plants and humans.[J]. International Journal of Molecular sciences,2013,14(2):3540-3555.

[5]Anna K,Picman,Edward F,Schneider,et al. Effect of flavonoids on mycelial growth of Verticillium albo-atrum[J]. Biochemical Systematics and Ecology,1995,23(7),683-693.

[6]Hiroyuki Haraguchi,Katsuhito Tanimoto,Yukiyoshi Tamura,et al. Mode of antibacterial action of retrochalcones from Glycyrrhiza inflata[J]. Phytochemistry,1998,48(1):125-129.

[7]?；?糜漫天,顧艷艷,等. 植物黃酮抗人白血病HL-60細胞增殖的結構-效應關系[J].2007,26(12):1309-1314.

[8]李德遠,周韞珍,余應利,等. 銀杏葉黃酮抗輻射效應研究[J].營養(yǎng)學報,2004,26(3):220-222.

[9]Nunes Tatiana P,Destro Maria Teresa,et al. Radioresistance of Salmonella species and Listeria monocytogenes on minimally processed arugula(Eruca sativa Mill.):effect of irradiation on flavonoid content and acceptability of irradiated produce.[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(4):1264-1268.

[10]周雯. 委陵菜黃酮衍生物抗糖尿病活性及其作用機制研究[D].天津醫(yī)科大學,2013.

[11]李響,萬建波,李銘源,等.葛根異黃酮類化合物抗動脈粥樣硬化藥理研究進展[J].中國新藥雜志,2010,19(8):662-665.

[12]賈娜,李曉崴,宋立,等. 響應面法優(yōu)化柿葉總黃酮的超聲波輔助提取條件[J]. 食品與發(fā)酵科技,2013,49(6):1-6.

[13]孫晶,狄蕊,尚美秀. 超聲波輔助提取水飛薊全草中總黃酮的工藝優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(24):239-242.

[14]王超,杜冰,謝藍華,等. 表面活性劑輔助酶法提取黃芪黃酮的工藝優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(23):227-231.

[15]宮坤,詹小龍,郭中婷,等. 表面活性劑輔助提取石榴葉中總黃酮工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(23):261-264,322.

[16]奚菊群. 異黃酮類化合物與表面活性劑之間的相互作用[D].揚州大學,2008.

[17]Yujie Wang,Eduardo F,Marques. Non-ideal behavior of mixed micelles of cationic gemini surfactants with varying spacer length and anionic surfactants A:Conductimetric study[J].Journal of Molecular Liquids,2008,142(1):136-142.

[18]肖曉瑩. 顯齒蛇葡萄黃酮化合物提取及其提取物抗氧化活性研究[D].福建農(nóng)林大學,2013.

Ultrasonic-assisted anionic and cationic surfactant systems extraction of total flavonoids fromAmpelopsisgrossedentata

ZHU Xin,GUO Hong-ying,TAN Xing-he*,YU Xiao-jie,ZHANG Yu,WANG Feng,DENG Jie-hong

(College of Food Science and Technology,Agricultural University Of Hunan,Changsha 410000,China)

The ultrasonic-assisted anionic and cationic surfactant systems extraction of total flavonoids was optimized by single-factor experiment and response surface methodology.The effects of surfactant concentration,the ratio of anionic surfactant to cationic surfactant,ultrasonic treatment time,solid/liquid ratio(g/mL)and temperature on the yield of total flavonoids were explored through single factor.Based on the optimum conditions of single factor experiment as SDS∶CTAB=40∶1、1∶20 and 60 ℃ for the ratio of anionic surfactant to cationic surfactant,solid/liquid ratio(g/mL)and temperature,The optimum extraction conditions were determined as 1.1%,40% and 57 min for surfactant concentration,ethanol concentration and extraction time,respectively.Under these conditions,the yield of total flavonoids fromAmpelopsisgrossedentatawas 23.27%,which was close to the predicted value of 23.45%. Therefore,the optimized extraction procedure is reliable.

Ampelopsisgrossedentata;flavonoids;ultrasound;surfactant;response surface methodology

2015-04-23

朱欣(1989-),男,在讀碩士研究生,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工,E-mail:1007495273@qq.com。

譚興和(1959-),男,教授,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工,E-mail:xinghetan@163.com。

國家自然科學基金項目(31371817);湖南省自然科學基金項目(2015JJ3076)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000