超聲輔助酶解制備紅豆多肽及其抗氧化性的研究

李　楊,齊寶坤,隋曉楠,馬文君,王中江,江連洲

(東北農業大學食品學院,哈爾濱 150030)

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超聲輔助酶解制備紅豆多肽及其抗氧化性的研究

李楊,齊寶坤,隋曉楠,馬文君,王中江,江連洲*

(東北農業大學食品學院,哈爾濱 150030)

采用超聲輔助酶解法制備紅豆多肽,并對其抗氧化性進行研究。在單因素實驗基礎上,采用響應面分析法對超聲輔助酶解制備紅豆多肽工藝進行優化,確定最優超聲輔助酶解工藝為:堿性蛋白酶添加量3.5%,超聲功率346 W,反應溫度60 ℃,反應時間92 min,反應pH8.4。在最優工藝條件下,紅豆多肽得率為85.84%。體系的抗氧化能力隨著多肽濃度的增加而增強,當多肽達到一定濃度后,多肽濃度不再是抗氧化能力的主要影響因素。

超聲波,酶解,紅豆多肽,抗氧化性

紅豆具有較高的營養價值,含有25%左右的蛋白質,并且氨基酸豐富,是一種優質的植物蛋白來源[1]。將蛋白質經過酶適度水解可以制備生物活性肽,其中抗氧化肽備受關注。目前國內對生物酶法制備紅豆多肽的相關研究有一些報道,程謙偉等[2]采用堿性蛋白酶水解紅豆蛋白制備紅豆多肽,在優化的酶解條件下,其水解度為45.82%。劉琪等[3]采用Protex 6L直接酶解紅豆粉制備紅豆多肽,多肽得率可達84.29%,同時采用凝膠過濾色譜分析發現紅豆蛋白中存在一些不容易被Protex 6L酶解的成分。梁英岳[4]采用堿性蛋白酶對紅豆蛋白進行酶解,研究其酶解物的抗氧化性,通過體積排阻色譜表明,分子量為588～967 Da的多肽段抗氧化活性最高。超聲波產生的空化效應和機械效應對物質的提取、酶解反應及高分子的降解等具有一定的促進作用,在超聲作用下進行酶解反應可以縮短酶解時間、提高酶解效率、增加產物得率[5]。Jia等[6]研究發現,采用蛋白酶酶解小麥胚芽蛋白的過程中,超聲預處理可以使疏水性氨基酸更快的釋放,促進小麥胚芽蛋白的酶解反應。宿哲然等[7]研究表明125 W、40 kHz的超聲作用能有效促進蛋清蛋白的酶解,水解度提高了13%～35.48%;然而對超聲輔助酶解制備紅豆多肽及其抗氧化性的研究較少,本文采用超聲輔助堿性蛋白酶對紅豆蛋白進行酶解制備紅豆多肽,通過響應面分析法對超聲輔助酶解工藝進行優化,并對紅豆多肽的抗氧化性進行研究,為紅豆抗氧化肽的研發及實際生產提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅豆(蛋白質21.2%、碳水化合物57.4%、脂肪0.7%、水分5.1%、灰分3.5%)市售;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L)(1.2×105U/mL)Novozymes公司;硫代巴比妥酸(TBA)國藥集團化學試劑有限公司;其它試劑國產分析純。

F2102型植物試樣粉碎機天津泰斯特儀器有限公司;pHS-3C型酸度計上海江儀儀器有限公司;精密電動攪拌機江蘇省金壇市榮華儀器;電熱恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠;LDZ5-2型臺式低速離心機上海安亭科學儀器廠;JY92-2D超聲探頭發生器寧波新芝生物科技有限公司;LGJ-25型冷凍干燥機上海醫用科學儀器廠;TU-1901型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1紅豆多肽的制備紅豆→粉碎→過篩→加水混合→堿提→離心分離→取上清液→酸沉→離心分離→取沉淀→反復水洗和離心→沉淀復溶→蛋白溶液→超聲輔助酶解→滅酶→離心分離→取上清液→調pH中性→冷凍干燥→紅豆多肽

取一定質量的紅豆粉碎后過50目篩,以料液比1∶6的比例加水混合配成混合液,用1 mol/L的NaOH溶液調節混合液pH為9進行堿提2 h,然后在4000 r/min下離心25 min取上清液,用1 mol/L的HCl溶液調節pH為4.5,在4000 r/min下離心25 min得沉淀,將沉淀反復水洗后離心分離,將沉淀復溶配成5%的蛋白溶液,調節蛋白溶液溫度和pH,加入堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)進行超聲輔助酶解,酶解后于95 ℃滅酶10 min,然后在4000 r/min下離心25 min取上清液,調節pH中性后冷凍干燥即得紅豆多肽。

1.2.2超聲輔助酶解工藝單因素實驗基本超聲輔助酶解條件為:堿性蛋白酶添加量3%,超聲功率300 W,反應溫度55 ℃,反應時間80 min,反應pH8。在其他條件不變的情況下,以多肽得率(%)為考察指標,分別選取堿性蛋白酶添加量為1%、2%、3%、4%、5%,超聲功率為100、200、300、400、500 W,反應溫度為45、50、55、60、65 ℃,反應時間為40、60、80、100、120 min,反應pH為6、7、8、9、10,進行單因素實驗。

1.2.3超聲輔助酶解工藝響應面實驗基于單因素實驗,采用Design-Expert 7.0軟件設計響應面分析實驗。以多肽得率R(%)為響應值,選擇堿性蛋白酶添加量A(%),超聲功率B(W),反應溫度C( ℃),反應時間D(min),反應pH E為影響因素,每個因素設定5個水平進行實驗,其因素水平編碼表見表1。

1.2.4紅豆多肽濃度對其抗氧化性的影響在最優的超聲輔助酶解工藝條件下制備紅豆多肽,配成濃度分別為0.1、1、10、100、1000 μg/mL的多肽溶液,測定多肽溶液的抗氧化能力,包括OH自由基清除能力和DPPH自由基清除能力,探討多肽濃度對其抗氧化性的影響。

表1　因素水平編碼表

1.2.5多肽得率的測定采用三氯乙酸可溶性氮法測定[8],將酶解后的上清液與質量分數10%的三氯乙酸等體積混合,在4000 r/min下離心20 min,采用Follin-酚法測定上清液中可溶性氮。多肽得率計算公式如下:

多肽得率(%)=N1/N0×100

式中:N1為三氯乙酸中的可溶性氮的量(mg);N0為原料中總氮的量(mg)。

1.2.6·OH自由基清除能力的測定·OH自由基清除能力的測定采用D-脫氧核糖-Fe體系法[9]。吸取0.1 mL 1%的多肽溶液,移入試管中,加入0.1 mL 1.04 mmol/L的EDTA溶液、0.1 mL 1 mmol/L的FeCl3溶液、0.1 mL 2 mmol/L的VC溶液、0.1 mL 10 mmol/L的H2O2溶液、0.1 mL 60 mmol/L的D-脫氧核糖溶液和0.4 mL pH7.5 KH2PO4-NaOH緩沖溶液37 ℃水浴1 h,加入1 mL 25%的HCl溶液終止反應,然后加入1 mL 1%的硫代巴比妥酸(TBA)溶液,100 ℃水浴15 min,冷卻后有沉淀,加入1 mL正丁醇萃取顏色,然后于532 nm處測定其吸光度。以不加多肽樣品的空白作對照,·OH自由基清除能力的計算公式如下:

式中:A0為不加樣品的空白吸光度;A1為加入D-脫氧核糖的樣品吸光度;A2為不加D-脫氧核糖的樣品吸光度。

1.2.7DPPH自由基清除能力的測定取2mL1%的多肽溶液于比色管中,加入2mL1mmol/L的DPPH乙醇溶液,充分混勻后在室溫下避光反應30min,反應結束后在517nm處測定其吸光度。對照組為2mL無水乙醇溶液與2mL樣液混合液的吸光度,空白組為2mLDPPH溶液與2mL蒸餾水混合液的吸光度,用無水乙醇調零。DPPH自由基清除能力的計算公式如下[10]:

式中:As為實驗組的吸光度;Ac為對照組的吸光度;Ab為空白組的吸光度。

1.2.8數據處理采用統計學軟件SPSS17.0對數據進行ANOVA差異顯著性分析,p<0.05為顯著性差異,采用Design-Expert7.0軟件進行方差分析,采用Origin8.0軟件作圖。

2　結果與分析

2.1超聲輔助酶解工藝單因素分析

2.1.1堿性蛋白酶添加量對紅豆多肽得率的影響由圖1可以看出,隨著堿性蛋白酶添加量的增加,多肽得率逐漸升高,當酶添加量增加到4%時,多肽得率達到最大;繼續增加酶添加量,多肽得率不再增大。隨著堿性蛋白酶的增加,將蛋白質水解為多肽的量增加,導致多肽得率升高;當蛋白酶達到一定量時,大部分蛋白質幾乎達到了水解平衡[11],蛋白酶添加量不會對多肽得率產生明顯影響。

圖1　堿性蛋白酶添加量對紅豆多肽得率的影響Fig.1　Effect of adding amount of Alcalase on red bean peptides yield

2.1.2超聲功率對紅豆多肽得率的影響由圖2可以看出,隨著超聲功率的增加,多肽得率呈先升高后下降的趨勢。當超聲功率為300 W時,多肽得率達到最大;繼續增加超聲功率,多肽得率反而又降低。超聲作用會使蛋白質的酶作用位點更多的暴露出來,促進蛋白質的酶解作用,導致多肽得率升高;當超聲功率過大時,空化作用和熱作用會使酶分子變性失活,導致多肽得率下降[12]。

圖2　超聲功率對紅豆多肽得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic power on red bean peptides yield

2.1.3反應溫度對紅豆多肽得率的影響由圖3可以看出,隨著反應溫度的升高,多肽得率逐漸增加,當反應溫度升高到55 ℃時,多肽得率達到最大;繼續升高反應溫度,多肽得率又會降低。蛋白酶具有一定的最適酶解溫度范圍[13],當超過該最適酶解溫度范圍,即溫度過高或過低時,使酶活性下降,影響酶解反應速率,不利于多肽的生成,導致多肽得率的降低。

圖3　反應溫度對紅豆多肽得率的影響Fig.3　Effect of reaction temperature on red bean peptides yield

2.1.4反應時間對紅豆多肽得率的影響由圖4可以看出,隨著反應時間的延長,多肽得率逐漸升高,當反應時間延長到100 min時,多肽得率達到最大;繼續延長反應時間,多肽得率不再升高并趨于穩定。在反應初期,底物濃度較大,隨著反應時間的延長,酶與底物作用明顯,使多肽得率增加,當反應達到一定程度后,底物濃度不斷降低,大部分蛋白質幾乎完全水解,多肽得率不會隨著反應時間的延長而進一步增加。

圖4　反應時間對紅豆多肽得率的影響Fig.4　Effect of reaction time on red bean peptides yield

2.1.5反應pH對紅豆多肽得率的影響由圖5可以看出,隨著反應pH的增加,多肽得率明顯升高,當反應pH增加到8時,多肽得率達到最大;繼續增加反應pH,多肽得率又會降低。蛋白酶都具有最適的pH范圍,只有在最適的pH范圍內才能發揮較好的酶解作用[14]。超出最適酶解pH范圍,即過酸或過堿時,會造成酶分子結構的破壞,引起酶活性的降低,不利于酶解反應,導致多肽得率的降低。

圖5　反應pH對紅豆多肽得率的影響Fig.5　Effect of reaction pH on red bean peptides yield

2.2超聲輔助酶解工藝響應面分析

以堿性蛋白酶添加量A(%)、超聲功率B(W)、反應溫度C( ℃)、反應時間D(min)和反應pH E為影響因素,以多肽得率R(%)為響應值,采用軟件Design-Expert 7.0來完成實驗設計與數據處理,實驗安排及結果見表2。

表2　實驗安排及結果

通過統計分析軟件Design-Expert 7.0進行數據分析,建立二次響應面回歸模型如下:

R=81.91-1.99A-0.080B+0.53C-0.048D-0.51E+1.11AB-0.54AC+2.07AD+0.57AE+4.04BC-3.39BD+0.86BE+0.42CD+1.06CE-1.23DE-0.60A2-2.90B2-1.50C2-2.99D2-1.79E2

對模型方程進行方差分析,回歸與方差分析結果見表3。

表3　回歸與方差分析結果

注:**表示極顯著(p<0.01),*表示顯著(0.01

兩因素交互作用(顯著項)對多肽得率影響的響應面見圖6。該模型中,BC和BD的交互作用顯著(p<0.01),而其他兩因素之間的交互作用均不顯著(p>0.05),說明超聲功率與反應溫度的交互作用和超聲功率與反應時間的交互作用對多肽得率影響較大。此外,圖中均有極值點出現,再次證明了超聲功率與反應溫度的交互作用和超聲功率與反應時間的交互作用對多肽得率的顯著影響。雖然超聲功率對多肽得率影響不顯著(表3),但其與其他因素的交互作用對多肽得率的影響顯著。

圖6　兩因素交互作用(顯著項)對多肽得率影響的響應面Fig.6　Response surface analysis of effective interaction(significant items)on peptides yield

通過分析軟件Design-Expert尋找最優超聲輔助酶解工藝條件。當堿性蛋白酶添加量、超聲功率、反應溫度、反應時間和反應pH對應的編碼值分別為-1.00、0.91、1.00、-0.78和0.81時,即堿性蛋白酶添加量為3.5%、超聲功率為346 W、反應溫度為60 ℃、反應時間為92 min、反應pH為8.4時,多肽得率有最大值為85.19%±1.63%。

為了驗證模型預測的準確性,在最優超聲輔助酶解工藝下,進行3次驗證實驗取平均值,多肽得率的平均值為85.84%與預測值85.19%±1.63%較接近,說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好。最終確定最優超聲輔助酶解工藝為:堿性蛋白酶添加量3.5%,超聲功率346 W,反應溫度60 ℃,反應時間92 min,反應pH8.4。

2.3紅豆多肽濃度對其抗氧化性的影響

蛋白質通過酶的適度水解形成的多肽具有一定的抗氧化能力,對·OH自由基、DPPH自由基等具有一定的清除能力[15]。圖7為不同濃度多肽對·OH自由基及DPPH自由基清除能力的影響,由圖7可以看出,隨著多肽濃度的增加,·OH自由基及DPPH自由基清除能力逐漸升高,這表明體系的抗氧化能力逐漸增強;當多肽濃度超過100 μg/mL后,體系抗氧化能力增強的趨勢減弱,這表明多肽達到一定濃度后,多肽濃度不再是抗氧化能力的主要影響因素。

圖7　多肽濃度對·OH自由基及DPPH自由基清除能力的影響Fig.7　Effect of peptides concentration on scavenging activity for ·OH and DPPH radicals

3　結論

本文對超聲輔助酶解制備紅豆多肽工藝進行研究,探討堿性蛋白酶添加量、超聲功率、反應溫度、反應時間和反應pH對紅豆多肽得率的影響。在單因素實驗基礎上,采用響應面分析法對超聲輔助酶解制備紅豆多肽工藝進行優化,確定最優超聲輔助酶解工藝為:堿性蛋白酶添加量3.5%,超聲功率346W,反應溫度60 ℃,反應時間92 min,反應pH8.4。在最優工藝條件下,紅豆多肽得率為85.84%?？寡趸苑治霰砻?體系的抗氧化能力隨著多肽濃度的增加而增強,當多肽達到一定濃度后,多肽濃度不再是抗氧化能力的主要影響因素。

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Research on preparation of red bean peptides by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis and antioxidative activity

LI Yang,QI Bao-kun,SUI Xiao-nan,MA Wen-jun,WANG Zhong-jiang,JIANG Lian-zhou*

(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Preparation of red bean peptides by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis and antioxidant activity were researched. On the basis of single factor experiment,hydrolysis process of preparing red bean peptides with ultrasonic assist were determined by response surface methodology. The optimal hydrolysis parameters were as follows:adding amount of Alcalase was 3.5%,ultrasonic power was 346 W,reaction temperature was 60 ℃,reaction time was 92 min and reaction pH was 8.4. Under the optimal process conditions,yield of red bean peptides was 85.84%. Antioxidant capacity was enhanced with the increase of peptides concentration. When peptides reached a certain concentration,peptides concentration was no longer the main influence factors of antioxidant capacity.

ultrasound;enzymatic hydrolysis;red bean peptides;antioxidant activity

2015-06-03

李楊(1981-),男,博士,副教授,研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:liyanghuangyu@163.com。

江連洲(1960-),男,博士,教授,研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:jlzname@yeah.net。

高等學校博士生學科點專項科研基金博導類資助課題(20132325110013);農業部崗位科學家(CARS-04-PS25)。

TS210

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000