糖尿病小鼠合并結(jié)核菌感染后TNF-α表達(dá)及腸黏膜病理形態(tài)學(xué)觀察

吳　華

(唐山市第四醫(yī)院(結(jié)核病醫(yī)院) 內(nèi)四病區(qū)，河北 唐山063000)

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糖尿病小鼠合并結(jié)核菌感染后TNF-α表達(dá)及腸黏膜病理形態(tài)學(xué)觀察

吳華

(唐山市第四醫(yī)院(結(jié)核病醫(yī)院) 內(nèi)四病區(qū)，河北 唐山063000)

糖尿病患者是結(jié)核病的高度易感人群[1,2]，與糖尿病免疫功能紊亂等病理機(jī)制密切相關(guān)[3]。糖尿病患者合并結(jié)核病后將導(dǎo)致糖尿病病情迅速加重。到目前為止對(duì)糖尿病病因機(jī)制的研究較深入，其中小腸黏膜屏障受損是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一[4]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：小腸黏膜屏障受損與多種細(xì)胞因子作用相關(guān)，TNF-α在該過程中起核心作用[5]。對(duì)結(jié)核桿菌感染后機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)研究證實(shí)，單一結(jié)核桿菌感染后機(jī)體TNF可出現(xiàn)表達(dá)異常[6,7]。鑒于以上結(jié)果，本研究將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病合并結(jié)核菌感染后是否出現(xiàn)TNF-α表達(dá)紊亂及是否存在與TNF-α相關(guān)的腸黏膜病理形態(tài)學(xué)改變，為糖尿病合并結(jié)核病時(shí)，結(jié)核病可能出現(xiàn)的通過TNF-α相關(guān)途徑影響腸黏膜屏障改變病理過程及臨床治療研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康清潔級(jí)ICR小鼠60只(18-22g，雌雄各半),由華北煤炭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.1.2藥物及檢測(cè)試劑鏈尿佐菌素(streptoxolocin，STZ)，弗氏完全佐劑(CFA)；Sigma公司；TNF-α，北京華英生物技術(shù)研究所提供；結(jié)核菌：我院檢測(cè)科分離的INH耐藥菌株。

1.2方法

1.2.1糖尿病模型制備A、B組小鼠第1天腹腔注射0.5mlCFA，次日按25mg·kg-1腹腔內(nèi)注射STZ[8]溶液，每周1次，連續(xù)3周后A組進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)及觀察。此模型屬遲發(fā)型糖尿病模型，有免疫學(xué)的改變，更接近人類IDDM的發(fā)生發(fā)展變化。

1.2.2糖尿病感染結(jié)核菌模型糖尿病模型建立2周后，將臨床分離的INH耐藥株經(jīng)B組小鼠皮下注射感染0.01MG，(2.5×104CFU)，合并結(jié)核感染模型建立后第8周進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)及觀察。

1.2.3TNF-α檢測(cè)于清潔環(huán)境，手術(shù)房間經(jīng)紫外線消毒，參加手術(shù)人員穿無菌手術(shù)衣，佩帶一次性口罩、帽子及無菌一次性手套，所用手術(shù)器械均經(jīng)高溫、高壓滅菌，接觸血樣物品均使用一次性用品。C組研究開始、A、B組模型制作完成并完全符合各組標(biāo)準(zhǔn)后第3和第8周，在水合氯醛麻醉下，取腹部縱切口打開腹腔，分離出下腔靜脈，分別用無菌注射器抽取血液進(jìn)行TNF-α檢測(cè)。

1.2.4小腸病理標(biāo)本的采集各組小鼠于抽血成功后繼續(xù)切取回盲部小腸組織5cm，將采集小腸沿腸系膜緣剖開,以細(xì)圓玻璃棒輕柔展平，把小腸組織的長(zhǎng)軸兩端用細(xì)小訂書釘固定于剪好的A4打印紙片上，用PBS緩沖液洗去腸壁上殘存的糞便、污垢。將其置入4%中性甲醛溶液中固定48小時(shí)以上(中間在固定標(biāo)本4小時(shí)后更換甲醛液一次),然后取出標(biāo)本,嚴(yán)格垂直定向石蠟包埋,切片,每只動(dòng)物標(biāo)本均連續(xù)切片10張,切片厚度為4μm，留作病理實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。HE染色病理學(xué)觀察。采用HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)觀測(cè)HE染色切片，隨機(jī)全盲觀測(cè)。在光鏡下(100倍)每個(gè)時(shí)相隨機(jī)計(jì)數(shù)為20個(gè)視野。腸損傷指數(shù)的計(jì)測(cè)根據(jù)Chiu等報(bào)告的腸黏膜損害指數(shù)(IntestinalmucosalesionIndex，IMLI)計(jì)分的標(biāo)準(zhǔn)判定[9]。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1小腸黏膜

2.1.1小腸黏膜HE染色病理形態(tài)學(xué)觀察

A組小鼠小腸黏膜的絨毛呈指狀突起，絨毛較長(zhǎng)，其高度是隱窩的數(shù)倍，其間有散在少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表面覆蓋以單層柱狀上皮細(xì)胞，其腸腔面可見濃集的刷狀緣。絨毛中軸的固有層結(jié)締組織內(nèi)可見1-2條縱形的毛細(xì)淋巴管。(圖1)

B組小腸黏膜絨毛稀疏水腫，變粗，變厚，形態(tài)規(guī)則整齊，絨毛頂端上皮下可見囊狀間隙，伴有毛細(xì)血管充血，杯狀細(xì)胞部分呈圓形，上皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則。(圖2)

C組正常小鼠小腸黏膜。(圖3)

圖1A組小腸黏膜(×40)圖2B組小腸黏膜(×40)圖3C組小腸黏膜(×40)

2.1.2小腸黏膜IMLI比較

顯示A、B兩組差異顯著(t=4.87；P<0.01)。(表1)

2.2血清TNF-α檢測(cè)結(jié)果比較

TNF-α指標(biāo)A、B兩組比較(t=2.88；P<0.01)；B、C兩組比較(t=5.98；P<0.01)；A、C兩組比較(t=2.99；P<0.01)。(表1)

3　討論

糖尿病腸黏膜屏障損傷最重要原因之一表現(xiàn)為腸黏膜支持系統(tǒng)異常，包括腸道微生態(tài)平衡失調(diào)、腸道血液供應(yīng)不足、腸動(dòng)力障礙和腸免疫系統(tǒng)受損等多種因素[10]。在上述單一或多因素作用下，小腸黏膜通透性增加，吸收形態(tài)學(xué)改變[11]，表現(xiàn)為小腸絨毛裂隙增多加深，上皮細(xì)胞微皺折，絨毛中軸篩狀孔等改變，使葡萄糖攝入增加，導(dǎo)致糖耐量降低，體重、脂肪增加等一系列改變。在這種黏膜變化過程中TNF-α發(fā)揮重要作用：研究證實(shí)糖尿病是一種持續(xù)低水平的慢性炎癥反應(yīng)[12-14]，炎性過程中細(xì)胞因子TNF-α升高[15]，作為一種慢性代謝性疾病，持續(xù)升高的TNF作為炎癥指標(biāo)直接參與腸黏膜損傷的病理過程[16]，包括激活中性粒細(xì)胞，釋放大量活性氧與彈性蛋白酶，刺激交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)使機(jī)體內(nèi)兒茶酚胺分泌增加，促進(jìn)白三烯(LT)、血栓素A2(TXA2)、血小板激活因子(PAF)等多種血管活性物質(zhì)釋放；誘導(dǎo)大量NO生成，此外，TNF-α可以增加線粒體膜的通透性，減弱線粒體的呼吸作用，減少線粒體細(xì)胞色素，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡;TNF-α引起的過多NO通過蛋白的氧化、硝化、S-亞硝化、c-GMP激活和細(xì)胞能量耗竭等機(jī)制造成腸黏膜屏障功能失調(diào)。最終造成腸黏膜血管、細(xì)胞受損、微循環(huán)障礙、腸黏膜缺血缺氧低灌流等情況,導(dǎo)致小腸黏膜病理形態(tài)學(xué)改變，屏障功能受損。本研究中糖尿病組TNF-α與與對(duì)照組比較有顯著意義的升高，同時(shí)出現(xiàn)小腸黏膜病理形態(tài)學(xué)改變(圖1)，與上述病理過程研究相符。而在共病組中TNF-α較糖尿病組出現(xiàn)更顯著升高，小腸黏膜病理形態(tài)學(xué)則表現(xiàn)更嚴(yán)重的改變(圖2)，這一結(jié)果與結(jié)核感染后機(jī)體發(fā)生TNF-α變化相關(guān)：結(jié)核感染后機(jī)體通過免疫相關(guān)基因等多種機(jī)制使TNF-α表達(dá)增加[17-18]，在糖尿病時(shí)糖、脂、蛋白及免疫功能紊亂，營(yíng)養(yǎng)不良、酸性環(huán)境、免疫調(diào)節(jié)紊亂等背景下，結(jié)核菌生長(zhǎng)繁殖加快，病情進(jìn)展迅速，進(jìn)而導(dǎo)致TNF-α呈持續(xù)過多性病理性升高[19]，在糖尿病本身TNF-α升高致腸黏膜損傷基礎(chǔ)上進(jìn)一步了強(qiáng)化該病理機(jī)制過程，從而表現(xiàn)出本研究中進(jìn)一步加重的病理形態(tài)學(xué)損傷。

表1　ABC組腸損傷指數(shù)及TNF-α結(jié)果分析

注：IMLI指標(biāo)AB兩組比較*P<0.01。TNF-α指標(biāo)AB兩組比較*P<0.01；BC兩組比較▲P<0.01；AC兩組比較▼P<0.01。

研究結(jié)果顯示，在整個(gè)研究過程中糖尿病組與合并組TNF-α、小腸黏膜損傷均呈顯著正相關(guān)。糖尿病小鼠感染結(jié)核后顯著升高的TNF-α加重本已存在的小腸黏膜屏障損傷，加劇糖尿病病理過程。除此之外，感染結(jié)核后進(jìn)一步升高的TNF-α還通過多途徑抑制胰島素作用及產(chǎn)生胰島素抵抗加劇糖尿病癥狀[20]，有關(guān)這一機(jī)制將在今后研究中繼續(xù)探討。這一結(jié)論完善了結(jié)核通過TNF-α損傷腸黏膜屏障機(jī)制加重糖尿病的病理過程，由于小鼠與人體存在腸黏膜結(jié)構(gòu)、免疫功能等方面的差異，今后在本研究基礎(chǔ)上將進(jìn)行進(jìn)一步糖尿病合并結(jié)核感染的人體活組織檢查，為臨床治療提供更可靠的依據(jù)。

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1007-4287(2016)08-1254-03

吳華，女，41歲，主治醫(yī)師，研究方向：結(jié)核內(nèi)科。

2015-09-12)