96gp負載樹突狀細胞聯合化療抗耐藥卵巢癌的研究

楊淑莉，司麗慧，吳　琦，馬語紅，林瑞新

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

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96gp負載樹突狀細胞聯合化療抗耐藥卵巢癌的研究

楊淑莉，司麗慧，吳琦，馬語紅，林瑞新*

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

目的探討96gp負載樹突狀細胞聯合化療抗耐藥卵巢癌的效果。方法使用樹突狀細胞中的96gp多肽復合物作為抗原來刺激樹突細胞從而增加抗原遞呈作用，加大對卵巢癌細胞的殺傷力，為臨床治療卵巢惡性腫瘤提供依據。選取一定的人卵巢癌細胞(SKOV3)和耐藥卵巢癌細胞(SKOV3/DDP)，從中提取gp96多肽復合物，對其進行鑒定，然后使用臍血將樹突細胞(DC)誘導后進行培養，待細胞成熟后將其和gp96相結合制成gp96-DC復合物，然后分別將一般DC和載有抗原的DC分別與臍血有核細胞、人外周血T淋巴細胞相結合，比較分析兩者對卵巢癌細胞和耐藥卵巢癌細胞的殺傷作用效果。結果gp96為熱休克蛋白，它與DC結合后的抗原樹突細胞對卵巢癌以及耐藥卵巢癌細胞的殺傷作用更大，單純DC對兩種癌細胞殺傷力較弱。結論gp96-DC在卵巢癌細胞和耐藥卵巢癌細胞中有很強的殺傷作用，為臨床卵巢癌的治療提供科學依據。

熱休克蛋白；gp96-肽復合物；樹突狀細胞；卵巢癌細胞；耐藥卵巢癌細胞

(ChinJLabDiagn,2016,20:1267)

卵巢癌在婦科的惡性腫瘤中屬于發病率較高、較為常見的疾病，5年內的生存率僅達20%-30%[1]。卵巢癌的高死亡率、發現晚并且預后差的特點嚴重危害了廣大女性的身體健康。卵巢癌的發病率占女性婦科惡性腫瘤疾病的20%左右[2]。死亡率在其他惡性腫瘤中排名第一。隨著醫療技術的發展，致癌因素的增加，但具體的發病原因尚未得到確切的理論認證，所以一些學者將研究熱點轉移到從腫瘤組織細胞中提取一種gp96的多肽物質，該物質為熱休克蛋白[3]，通過該抗原提取物和樹突細胞結合參與卵巢癌細胞的治療當中，探討其殺傷癌細胞的作用效果，現報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

本次實驗所用的臍帶血來自于我院足月分娩的產婦，將臍帶血收集后放入無菌的真空血袋中，血袋提前加入抗凝劑，密封好后于4℃冰箱里存儲24 h。而實驗所需要的人體卵巢癌細胞以及耐藥卵巢癌細胞的樣本來源于中國科學院上海生命科學研究院。實驗應用層析法提取蛋白質所需的試劑來源于美國Phamacia公司[4]，電泳試劑來源于Sigma公司，gp96檢測所使用的試劑來源于MBL公司，淋巴細胞的分離液來源于中國醫學科學院血研所科技公司。

1.2方法

1.2.1從卵巢癌細胞中提取gp96-肽復合物(1)將卵巢癌的細胞株濃度調為1×109/ ml，使用加熱器加熱至43℃，放置2 h后，再將細胞株重新加熱至37℃，放置2 h。(2)將加熱后的細胞株放入超聲細胞粉碎儀進行粉碎，時間為0.5 h，時間到后取出細胞液體備用。(3)將卵巢癌細胞液離心提取上清液，分別經過0.8、0.65、0.45、0.22 μm這四個不同直徑的微孔濾膜過濾，透析、過夜，換液兩次后分裝備用。(4)裂解后的卵巢癌細胞株，會沉淀出硫酸銨，經過鈉鹽的洗脫[5]，再使用紫外分光光度計進行濃度的測定。

1.2.2 制備gp96-DC復合物將臍血有核細胞進行分離后加入24孔細胞培養板，2.5 d進行一次換液，4d后將DC分為2組：一組為gp96-DC、另一組為無抗原DC。分別培養，在第3、6、9 d后于顯微鏡下觀察、拍照。比較含有抗原的DC組和不含有抗原的DC組分別對卵巢癌細胞以及耐藥卵巢癌細胞的殺傷作用。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0對所得資料進行統計學分析，計量資料采用t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，兩組比較P<0.05表示有顯著統計學差異。

2　結果

2.1gp96的鑒定

經過聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析得出，在分子量96 kD有一條清晰的染色帶，經過初步的鑒定該色帶為熱休克蛋白gp96，及從卵巢癌細胞中提取出來的物質就是熱休克蛋白gp96。

2.2DC細胞形態學的觀察和DC細胞表型分析

在顯微鏡下觀察的第3 d，臍血有核細胞聚集后形成細胞聚體，一部分細胞成為聚體后會變形、拉長，觀察的第9 d發現明顯的樹枝狀凸起的樹突細胞，疏松的貼壁生長或者懸浮生長，該細胞鑒定為典型的DC細胞。流式細胞儀的作用是鑒定DC培養后的特異性標志物，與DC細胞培養前比較，CD1a、CD83、刺激的分子CD86與MHCⅡ類分子HLA-DR的表達率和平均熒光強度都有很大程度的提高，兩組前后比較有顯著統計學差異(P<0.01)。

2.3經過激發的DC對腫瘤細胞的殺傷效果

DC經過一定的抗原刺激以后，較之前對腫瘤細胞的殺傷力更強，作用效果更為明顯，詳見表1。

表1　DC激發臍血有核細胞體外對腫瘤的殺傷作用

注：有核細胞組為對照組，DC+有核細胞組與對照組比較P<0.05；DC+Ag+T細胞組與對照組比較P<0.01；DC+Ag+有核細胞組與DC+有核細胞組比較P<0.01.

2.4經過DC活化后的T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用效果

經過抗原刺激后的DC細胞對腫瘤細胞殺傷力明顯增加，而經過DC活化后的T細胞同樣對腫瘤細胞有顯著的殺傷力，詳見表2。

3　討論

腫瘤組織中的熱休克蛋白gp96可以激發抗腫瘤的排斥反應，從而開始誘導機體產生特異性的CTL[6]，將腫瘤細胞殺除。gp96與免疫抗原相結合成為多肽復合物后，對癌細胞殺傷作用更強。DC屬于抗原提呈細胞，它的抗原提呈功能最強[7]，在抗原細胞和免疫應答細胞之間充當橋梁的作用，DC分泌細胞因子、抗原肽小體，根據需要進行體內的免疫調節。gp96與DC結合后，大大減少了溶酶體的降解作用，從而保存了gp96的完整性[8]，對CD8+T細胞有直接激活作用，gp96在抗原提呈這一過程中成為關鍵因素。

臍帶血的有核細胞經過抗原提呈以后，對卵巢細胞和耐藥卵巢細胞有一定的殺傷作用。DC刺激臍帶血有核細胞以后，它的殺傷活性更甚[9]，兩組比較有明顯的統計學差異；而gp96-DC要比單純DC殺傷力更強，實驗結果中可以看出，二者對腫瘤細胞殺傷作用有顯著的統計學差異。通過臍帶血有核細胞的殺傷效果中可以推斷出卵巢癌患者以及耐藥卵巢癌患者究竟是否可以輸入臍血，是否可以通過對帶有熱休克蛋白gp96抗原的DC進行刺激來實施臨床的免疫法治療卵巢癌患者和耐藥卵巢癌患者。研究顯示[10]，臍帶血有核細胞可以被體內的DC所刺激從而變成有殺傷力的效應細胞，對卵巢癌細胞進行殺除，這一作用機理尚未得到確切理論說明。

表2　經過DC活化后的T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用

注：T細胞組為對照組，DC+T細胞組與對照組比較P<0.05；DC+Ag+T細胞組與對照組比較P<0.01；DC+Ag+T細胞組與DC+T細胞組比較P<0.05.

Gp96-肽復合物致敏的DC能夠活化卵巢癌細胞外周血的T淋巴細胞，從而對腫瘤細胞產生殺傷性。gp96-DC要比單純的DC殺傷效果更好，其原因在于T細胞活化后可以提高殺傷力[11]，DC還具有激活靶細胞的能力，這一研究結果為日后DC疫苗研發提供科學的理論依據，針對長期化療后耐藥的卵巢癌患者，gp96-DC疫苗的研發最適合[12]。

綜上所述，gp96-DC比單純DC作用卵巢癌細胞效果更強、更為有效。免疫治療在卵巢癌細胞和耐藥卵巢癌細胞治療上已經取得了一定程度的進展，它的關鍵核心在于解決卵巢癌患者耐藥性，gp96-DC疫苗將成為未來新的課題方向。

[1]楊淑莉,金月梅,付莉,等.負載gp96多肽復合物的樹突狀細胞抗耐藥卵巢癌細胞株作用的實驗研究[J].中國婦幼保健,2008,23(33):4759.

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[3]馬薇.臍血樹突狀細胞介導的卵巢癌細胞株HO-8910免疫治療的體外實驗研究[D].蘭州醫學院,2001.

[4]馬靜.樹突狀細胞疫苗誘導抗子宮內膜癌細胞毒性反應的體外研究[D].河北醫科大學,2007.

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[6]李金鳳,張震宇,王淑珍,等.卵巢癌細胞和臍血樹突狀細胞融合瘤苗抗腫瘤免疫效應的初步研究[J].中國腫瘤臨床,2007,34(14):789.

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Study of 96gp dendritic cells loaded with chemotherapy resistant ovarian cancer

YANG Shu-li,SI Li-hui,WU Qi,et al.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveTo investigate the 96gp pulsed dendritic cells combined with chemotherapy resistant ovarian cancer effect.Methodsuse of dendritic cells in the 96gp peptide complexes as anti the original stimulus dendritic cells and antigen presentation function，increase the lethality of ovarian cancer cells，so as to provide basis for clinical treatment of ovarian malignant tumor.Selection of human ovarian cancer cells SKOV3 and resistant ovarian cancer cells (SKOV3/DDP)，from extraction gp96 peptide complexes，carries on the appraisal，and the use of umbilical cord blood dendritic cells (DC) after induction were cultured，until the mature cells will gp96 and its combination made gp96-DC complex，then the general DC and carrying of dendritic cell (DC) respectively and umbilical cord blood have combination of nuclear cells and human peripheral blood T lymphocytes，a comparative analysis of both on ovarian cancer cells and resistant ovarian cancer cell killing effects.Resultsgp96 heat shock protein，it combined with DC after antigen dendritic cells in ovarian cancer and the killing effect of resistant ovarian cancer cells more，with DC of two cancer cells lethal weak.Conclusiongp96-DC has strong killing effect on ovarian cancer cells and ovarian cancer cells，provide scientific basis for clinical treatment of ovarian cancer.

heat shock protein;gp96- peptide complex;dendritic cells;ovarian cancer;ovarian cancer cells

吉林省衛生廳課題(2009Z065)

1007-4287(2016)08-1267-03

R737.31

A

2016-03-15)