大鼠認知障礙對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌糖原合成酶激酶-3β表達水平的關系*

杜森，葉琳，朱琳，李陽陽，夏春波

（桂林醫學院 人體解剖學教研室，廣西 桂林 541004）

·論著·

大鼠認知障礙對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌糖原合成酶激酶-3β表達水平的關系*

杜森，葉琳，朱琳，李陽陽，夏春波

（桂林醫學院 人體解剖學教研室，廣西 桂林 541004）

目的探討大鼠認知障礙對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表達的關系，為糖代謝的神經調節機制研究提供新的實驗依據。方法Aβ1-42大鼠海馬內注射構建認知障礙模型，血糖儀檢測大鼠空腹血糖（FPG），半定量反轉錄-聚合酶鏈反應法（RT-PCR）檢測肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA的表達，蛋白印跡法（W estern blot）檢測肝臟與骨骼肌GSK-3β的表達。結果①實驗組大鼠FPG為（7.99±0.15）mmol/L，與假手術組和對照組比較顯著升高（P＜0.05）。②實驗組大鼠肝臟和骨骼肌GSK-3β mRNA表達水平分別為（0.47±0.03）和（0.26±0.02），與假手術組和對照組比較均明顯升高（P＜0.05）。③實驗組大鼠肝臟和骨骼肌GSK-3β表達水平分別為（0.47±0.04）和（0.26±0.03），均顯著高于假手術組與對照組（P＜0.05）。結論大鼠認知障礙可引起血糖水平的升高，其機制可能與認知障礙大鼠肝臟和骨骼肌GSK-3β表達升高有關。

認知功能障礙；糖代謝；糖原合成酶激酶-3β

老年癡呆是一種常見的慢性神經退行性病變，又名“阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD）”。其發生發展與海馬功能的受損密切相關，老年癡呆包括輕度認知障礙前期（pre-MCI）、輕度認知障礙期（mild cognitive impairment，MCI）和癡呆期3個時期，且其發展成不可逆轉的趨勢。AD與糖尿病（diabetes mellitus，DM）關系密切，有些學者稱之為“3型糖尿病”［1-2］。有研究顯示［3］，81%的AD患者伴隨有糖代謝異常。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）在糖代謝的過程中扮有重要的角色，為進一步探討AD對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌GSK-3β表達水平的關系，本實驗擬建立大鼠認知障礙模型，探討其對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌GSK-3β表達的關系，為糖代謝的神經調節機制研究提供新的實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

由桂林醫學院實驗動物中心（合格證號：SCXK桂2007-000）提供健康SD大鼠30只，雌雄不分，體重約200～250 g。水合氯醛由桂林醫學院附屬醫學院提供，微量注射器購自西化儀（北京）科技有限公司，Aβ1-42購自美國Sigma公司，血糖試紙購自強生（上海）醫療器材有限公司，Trizon總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，Rever tAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒購自美國Ther mo公司。由美國Invitrogen公司在GSK-3β、β-actin基因序列上設計并合成引物，GSK-3β正向引物：5'-CACCTGCCCTCTTCAACTTTAC-3'，GSK-3β 反向引物：5'-GGTCTGTCCACGGTCTCCA-3'，產物為158 bp；β-actin正向引物：5'-GAGGGAAATCGTGC GTGAC-3'，β-actin反向引物：5'-CTGGAAGGTGGA CAGTGAG-3'，產物為445 bp。辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，β-actin pAb、GSK-3β pAb購自美國 Bioworld Technology公司。

1.2大鼠認知障礙模型的構建及實驗分組

本實驗分為實驗組、假手術組和對照組，每組10只大鼠。實驗組大鼠海馬內注射 Aβ1-42 15μg，假手術組海馬內注射等體積的PBS緩沖液，對照組不作任何處理。具體操作步驟為：采用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔麻醉（3ml/kg），頭部備皮，依照大鼠腦立體定位圖譜將大鼠固定于腦立體定位儀上，沿其頭頂正中切開長約8mm的縱形切口，充分暴露前囟，小型電鉆鉆開左側海馬上方顱骨（前囟后3.8mm，左旁開2.2mm），不同組別采用微量注射器緩慢垂直進針2.9mm注入相應的試劑，縫合皮膚，并在縫合口處涂抹青霉素，以防感染，繼續飼養（每周換3次墊料）。運用Morris水迷宮實驗檢測大鼠認知功能。認知功能障礙評定標準：大鼠定位航行時間、跨越平臺次數及在原平臺象限時間百分比這3項指標中的任意2項與對照組比較差異有統計學意義，則判定為認知功能障礙。

1.3大鼠空腹血糖水平的檢測

造模后大鼠繼續飼養45 d，利用血糖儀檢測大鼠空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG），具體操作方法：大鼠空腹12 h，75%酒精清潔大鼠尾尖，消毒手術剪，剪去少許尾尖，使血液自然流出，按照血糖儀說明書檢測大鼠FPG水平。

1.4大鼠肝臟與骨骼肌組織樣本采集

采用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔麻醉（3ml/ kg），腹部及大腿備皮，打開腹腔和大腿處皮膚，剪取部分大鼠肝臟以及骨骼肌分別裝入凍存管，然后快速放入液氮灌中，12 h后將凍存管從液氮灌轉移至-80℃冰箱冷凍保存。

1.5RT-PCR法測定肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA的表達水平

從-80℃冰箱取出肝臟（骨骼肌）組織并在液氮中研磨充分，利用Trizon總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度，A260/A280比值在1.8～2.0為最佳，置入-80℃冰箱內短時間冷凍保存備用，用RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒逆轉錄總RNA最終得到穩定的cDNA，然后分別運用GSK-3β引物和β-actin引物進行PCR擴增，反應條件為：預變性94℃2min，變性94℃ 30 s、退火65℃ 30 s、延伸72℃ 30 s共32個循環，終延伸72℃ 2min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，全自動數碼凝膠成像分析系統拍照，計算光密度值并加以分析。

1.6蛋白印跡法（Western blot）法測定肝臟與骨骼肌GSK-3β的表達水平

從-80℃冰箱取出肝臟（骨骼肌）組織并在液氮中研磨充分，加入到盛有適量RIPA組織細胞裂解液的EP管中，充分震蕩，靜置15min，快速離心并吸取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測所提取蛋白質濃度，制備上樣蛋白樣本，按照步驟：蛋白樣本SDS-PAGE電泳→轉膜→封閉→TBST洗膜→孵育GSK-3β（β-actin）一抗→TBST洗膜→孵育二抗→TBST洗膜→發光，逐步操作。測定蛋白條帶光密度值，并分析。

1.7統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，組間差異性比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差分析有統計學意義，兩兩比較用LSD-t或Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1模型建立結果

大鼠飼養45 d后，實驗組大鼠死亡1只，存活9只，且表現為體型變瘦，皮毛粗糙，運動遲緩；假手術組大鼠死亡1只，存活9只；對照組大鼠無死亡，存活10只。實驗組與對照組大鼠體征無差異。

2.2Morris水迷宮實驗對各組大鼠認知功能的檢測結果

對各組大鼠運用水迷宮實驗檢測認知功能結果顯示，實驗組大鼠定位航行時間為（85.19±2.41）s，明顯高于假手術組與對照組的（43.80±10.32）s和（47.20±11.24）s（P＜0.01）；在空間探索實驗中實驗組大鼠跨越平臺的次數、在原平臺象限時間百分比分別為（1.78±0.93）次、（18.43±5.75）%，與假手術組和對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；而假手術組與對照組的所有指標比較差異無統計學意義（P1=0.434，P2=0.304，P3=0.061）（見附表）。結果提示本實驗構建認知障礙大鼠模型取得良好的效果。

2.3各組大鼠空腹血糖檢測結果

利用血糖儀檢測大鼠FPG水平結果顯示，實驗組大鼠FPG為（7.99±0.15）mmol/L，假手術組和對照組分別為（5.36±0.30）和（5.42±0.24）mmol/L，與假手術組和對照組比較，實驗組大鼠FPG水平顯著增高（P＜0.01），而假手術組和對照組FPG水平比較差異無統計學意義（P=0.895）。

附表　大鼠認知功能檢測結果 （）

附表　大鼠認知功能檢測結果 （）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與假手術組比較，P＜0.01

組別跨越平臺次數/次對照組（n=10）　47.20±11.24　36.67±3.21　5.67±0.54假手術組（n=9）　43.80±10.32　34.34±4.32　4.94±0.62實驗組（n=9）　85.19±2.411）2）　18.43±5.751）2）　1.78±0.931）2）定位航行時間/s原平臺象限時間/%

2.4半定量反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定肝臟與骨骼肌GSK-3βmRNA的表達水平結果

運用RT-PCR法檢測各組大鼠肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA表達水平結果顯示，實驗組肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA表達水平分別為（0.47± 0.03）和（0.26±0.02），與對照組及假手術組比較均顯著升高（P＜0.001），假手術組與對照組比較差異無統計學意義（P1=0.066，P2=0.258），其中β-actin擴增產物長度為445 bp，GSK-3β擴增產物長度為158 bp。見圖1～3。

2.5Western blot法測定肝臟與骨骼肌GSK-3β表達水平結果

圖1　肝臟GSK-3β mRNA的表達

圖2　骨骼肌GSK-3β mRNA的表達

圖3　肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA的表達情況

運用 Western blot法檢測肝臟與骨骼肌GSK-3β表達水平結果顯示，實驗組大鼠肝臟與骨骼肌GSK-3β表達水平分別為（0.47±0.04）和（0.26± 0.03），與假手術組和對照組比較均明顯升高（P＜0.001），而假手術組與對照組比較差異無統計學意義（P1=0.466，P2=0.542），其中β-actin分子量為43 kD、GSK-3β分子量為46 kD。見圖4～6。

圖4　肝臟GSK-3β的表達水平

圖5　骨骼肌GSK-3β的表達水平

圖6　肝臟與骨骼肌GSK-3β的表達情況

3　討論

隨著人口老齡化進展加快，AD嚴重威脅人類的健康，據統計截止到2010年，我國AD患者已達到569萬［4］。近年來越來越多研究表明［5］，AD與糖尿病具有復雜的相互關系。目前，糖尿病可促進AD的發生、發展已漸漸被人們所認可，但AD是否可以引起外周血糖水平的異常尚不清楚。SCHULINGKAMP等［6］研究發現，大腦的一些結構如海馬、額葉皮質等也可合成并分泌胰島素，大腦內的胰島素可以調節血糖的水平、食物的攝入、體重等。RIVERA等［7］認為，AD患者大腦額葉組織中胰島素水平降低。李欽云等［8］通過126例AD患者研究發現，AD患者存在血糖水平升高以及胰島素抵抗。有國內學者發現［9］，PD患者認知功能障礙和病情程度可能與血糖水平沒有明顯的關系，可能與多因素影響血糖水平有關，具體機制有待研究。本研究通過大鼠海馬注射Aβ1-42構建認知障礙模型，采用血糖儀檢測大鼠FPG水平，結果顯示，實驗組大鼠FPG水平與假手術組和對照組比較顯著升高（P＜0.05），提示大鼠認知功能障礙可能會引起血糖水平升高。

大腦海馬不僅是參與學習記憶相關的重要結構，而且其與周圍一些腦組織具有廣泛的神經纖維聯系，例如海馬與下丘腦室旁核（PVN）之間具有直接的神經聯系，下丘腦－垂體－腎上腺皮質軸（HPA軸）的激活點位于PVN，HPA軸是神經內分泌途徑的主要傳出通路。有報道，損傷海馬的結構如腹側下腳可增加糖皮質激素的釋放［10］。由此可知，海馬可參與神經內分泌的調節。XU等［11］研究發現，海馬可以通過神經通路參與胃動力的調節。劉梅等［12］通過對SD大鼠海馬內微量注射胃動素發現大鼠十二指腸消化間期移行性復合肌電活動發生了顯著性的變化，但是當切斷膈下迷走神經后海馬對十二指腸消化間期移行性復合肌電活動的影響幾乎消失，因此，海馬可能會通過海馬－下丘腦－腦干－迷走神經通路調節胃腸道的運動。

GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅是糖代謝的關鍵酶，并且參與胰島素信號通路的調節，GSK-3β可以通過抑制GS的生物活性，從而降低肝（肌）糖原的合成，導致血糖水平升高。本研究通過運用RT-PCR法與Western blot法檢測大鼠肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA與GSK-3β的表達水平發現，實驗組大鼠肝臟與骨骼肌GSK-3β表達水平與假手術組和對照組比較，均顯著升高（P＜0.05），提示認知障礙大鼠血糖水平的升高可能與肝臟和骨骼肌GSK-3β表達水平升高有關。也有研究表明［13］，AD患者大腦內GSK-3β水平及活性顯著升高。海馬作為大腦邊緣系統的重要組成部分可能通過自主神經參與機體調節［12］。推測認知障礙大鼠可能由于海馬神經元受損導致其肝臟與骨骼肌GSK-3β表達升高，進而引起血糖水平的上升。認知障礙大鼠出現血糖升高的機制復雜，GSK-3β作為調控糖代謝的關鍵酶，其表達水平的升高可為海馬作為中樞神經系統的一個重要組成部分參與糖代謝調節提供新的依據。

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（張蕾編輯）

Eeffects of cognitive im pairm ent in rats on glucose metabolism and its relationsw ith expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle*

Sen Du，Lin Ye，Lin Zhu，Yang-yang Li，Chun-bo Xia
（Department of Anatomy，Guilin Medical University，Guilin，Guangxi，541004，China）

Ob jective To investigate the effects of cognitive impairment in rats on glucose metabolism and its relation with the expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle，and to provide a new experimental evidence for study of the neural mechanisms regulating glucose metabolism.M ethods The Aβ1-42 was injected into the hippocampus to build cognitive impairmentmodel of rats，and fasting blood glucose of ratswas tested by blood glucosemeter.Expression of GSK-3βmRNA and GSK-3βin liver and skeletalmuscle were detected by RT-PCR and Western blot，respectively.Results In the experimental group，fasting blood glucose（FPG）was（7.99±0.15）mmol/L，which was significantly higher than that in the sham group and the control group（P＜0.05）.The expressions of GSK-3βmRNA in liver and skeletalmuscle of the experimental group were（0.47±0.03）and（0.26±0.02），which were significantly higher than other two groups（P＜0.05）.The expressions of GSK-3βin liver and skeletalmuscle of the experimental group were（0.47±0.04）and（0.26±0.03），which also higher than other groups significantly（P＜0.05）.Conclusions Cognitive impairment in rats causes the elevation of glucose levels，which mechanism may related to the increase of expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle.

cognitive；impairment；glucosemetabolism；glycogen synthase kinase-3β

R 338.26

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.001

1005-8982（2016）12-0001-05

2015-12-20

國家自然科學基金資助項目（No：81260137）

夏春波，E-mail：xiachunbo910@163.com；Tel:13977378285