牙本質基質蛋白1和腫瘤壞死因子-α對漢灘病毒感染的臍靜脈內皮細胞的作用*

史東沙，董艷迎，趙麗華，謝明

（1.西安交通大學醫學部 免疫學與病原生物學系，陜西 西安 710061；2.西安交通大學第二附屬醫院 檢驗科，陜西 西安 710061）

論著

牙本質基質蛋白1和腫瘤壞死因子-α對漢灘病毒感染的臍靜脈內皮細胞的作用*

史東沙1，董艷迎1，趙麗華2，謝明1

（1.西安交通大學醫學部 免疫學與病原生物學系，陜西 西安 710061；2.西安交通大學第二附屬醫院 檢驗科，陜西 西安 710061）

目的探討腫瘤壞死因子-α和牙本質基質蛋白1對漢灘病毒感染的臍靜脈內皮細胞通透性的影響，為闡明腎綜合征出血熱發病過程中通透性增高的機制提供實驗基礎。方法首先用免疫細胞化學方法檢測牙本質基質蛋白1在臍靜脈內皮細胞的表達情況，然后通過Transwell單層細胞模型系統檢測外源性腫瘤壞死因子-α和牙本質基質蛋白1對漢灘病毒感染的血管內皮細胞通透性的影響。結果牙本質基質蛋白1可以在血管內皮細胞表達，漢灘病毒感染對牙本質基質蛋白1表達量無顯著性影響，漢灘病毒感染后加入腫瘤壞死因子-α使牙本質基質蛋白1表達量顯著性增加（P＜0.05）。單純漢灘病毒感染后，通透性無顯著性變化（P＞0.05），而感染細胞加入外源性腫瘤壞死因子-α或牙本質基質蛋白1后，內皮細胞通透性顯著增加（P＜0.05），兩者聯合作用能促進通透性進一步增加（P＜0.05）。結論牙本質基質蛋白1廣泛表達在血管內皮細胞，腫瘤壞死因子-α和牙本質基質蛋白1均可使漢灘病毒感染的臍靜脈內皮細胞通透性顯著增高，且兩者存在聯合作用。

腎綜合征出血熱；transw ell單層細胞模型系統；通透性

腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever renal syndrome，HFRS）是一種以發熱、出血和急性腎功能損害為主要特征的急性傳染病，漢坦病毒（Hantavirus，HV）是HFRS的病原體，目前已經確認的漢坦病毒有23種，在我國流行的主要為漢灘型（hantaan virus，HTNV）［1-2］。HFRS的具體機制尚未闡明，但是HFRS發病過程中存在的免疫病理損傷已被公認，其基本病變是血管內皮細胞損傷和滲透性增加導致的有效血容量下降，研究表明HFRS血管內皮損傷的機制可能為病毒感染的免疫細胞釋放的細胞因子作用：如病毒感染的單核/巨噬細胞釋放的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）在病程中表達異常并與血管內皮細胞損傷相關，TNF-α在HFRS患者中水平增高，且與疾病的嚴重程度密切相關，但TNF-α發揮作用的具體機制尚不清楚［3］。

牙本質基質蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）屬于小整合素結合配體N端聯接糖蛋白家族（small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein family，SIBLING）［4］。最早在牙本質和骨組織中被發現，近期發現DMP1表達廣泛，在頜下腺組織和腫瘤組織中均有表達［5-6］。近期研究發現，DMP1可以通過激活其伴侶基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）降解基底膜的Ⅳ型膠原和黏著連接的組成成分血管內皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin），該過程可能會導致通透性的增高。而近期有研究顯示TNF-α可以促進MMP9的表達［7］，因而推測TNF-α和DMP1可能在HFRS患者通透性增高過程中發揮聯合作用。

本研究的目的是，通過免疫細胞化學技術檢測DMP1在 HTNV感染的臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的表達情況，以及TNF-α對其表達量的影響。并通過Transwell單層細胞模型系統檢測DMP1及TNF-α對HTNV感染的HUVEC通透性的影響。為闡明HFRS發病過程中通透性增高的機制提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1細胞和病毒

原代HUVEC購自上海澳賽爾斯公司，采用該公司的內皮細胞完全培養基培養，內含內皮基礎培養液，10%的胎牛血清和2%的生長因子添加劑（含表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、環磷酸腺苷、肝素、醋酸氫化可的松、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B溶液等）。細胞培養瓶提前用0.25%的明膠（美國Sigma公司）包被以保證細胞能均勻生長。所有實驗均保證細胞控制在p3到p5代內使用。非洲綠猴腎細胞（African green monkey kidney cell，VERO）和漢灘病毒國際標準株HTNV 76-118由第四軍醫大學唐都醫院感染科王平忠教授惠贈。采用免疫熒光化學方法鑒定病毒在細胞的復制情況，并采用Reed-Muench法測定病毒滴度。

1.2間接免疫熒光檢測病毒感染情況

VERO細胞在24孔板培養，待細胞融合至50%～60%時棄去培養基，加入HTNV懸液37℃培養2 h后棄去病毒懸液加入新鮮培養基繼續培養，病毒感染3 d后采用間接免疫熒光方法進行檢測。首先，用4%的多聚甲醛4℃固定20min，然后采用0.5%的TritonX-100室溫通透10min，5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉30min，然后加入鼠抗人HTNV 1A8抗體（第四軍醫大學唐都醫院感染科王平忠教授惠贈，1∶1 000稀釋）4℃過夜。然后加入羊抗鼠異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）（中國北京中杉金橋生物公司）37℃孵育1 h。每一步結束后均用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，每次5min。最后在熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）上觀察。

1.3免疫細胞化學法檢測DMP1在HUVEC的表達

將HUVEC爬片后用HTNV（感染復數=1）感染，3 d后加入TNF-α刺激30 min，PBS沖洗后加入4%的多聚甲醛4℃固定20min，加入0.5%的TritonX-100室溫通透10min，PBS沖洗3×5min，除去PBS，每張玻片加50μl內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10min，PBS沖洗3×5min，除去PBS，每張玻片加入50μl二抗動物非免疫血清，室溫下孵育15min；甩干玻片上的血清，每張蓋玻片上滴加鼠抗人DMP1一抗（美國Santa Cruz公司，1∶100稀釋）4℃過夜，PBS沖洗3×5min，除去PBS，每張玻片加50μl生物素標記的羊抗鼠二抗（福州邁新生物技術開發有限公司），37℃放置1 h，PBS沖洗3×5min；除去PBS，每張玻片滴加50μl鏈霉素抗生物素過氧化物酶溶液，室溫下孵育10min，PBS沖洗3×5min；除去PBS，每張玻片滴加一滴新鮮配制的二氨基聯苯胺顯色液，室溫下顯色2～10min，在顯微鏡下控制染色時間；將染色液沖洗干凈，干燥后中性樹膠封片，將樣品置于顯微鏡下觀察。陰性對照組用PBS代替一抗進行反應。圖像半定量分析：顯微鏡觀察，每組隨機取15個視野，Image-Pro Plus 6.0分析各視野下平均光密度值（average optical density，AOD）。AOD為陽性目標光密度和陽性面積比（IOD/area），代表待測抗原的量。

1.4Transwell單層細胞模型系統檢測HUVEC的通透性變化

HUVEC接種于基質膠（10μg/m l）包被的Costar Transwell單層細胞模型系統（孔徑3μm），HUVEC生長在內皮細胞完全培養基，細胞密度是3×104個；HTNV感染transwell系統中的HUVEC 3 d后，細胞密度接近100%，長成均勻致密單層，HUVEC在內皮基礎培養基中饑餓過夜；FITC標記的葡聚糖（FITC-dextran，0.5mg/m l）加入Transwell的上室，在相應組加入TNF-α（10 ng/ml），DMP1（100 nmol/L），一式3份。反應30min后，從每個transwell的下室吸取100μl樣品，樣品中葡聚糖的含量在熒光酶標儀（490 nm處激發，530 nm處發射）中檢測，以檢測樣本中的相對熒光強度來反映TNF-α，DMP1與HTNV對HUVEC通透性的影響。

1.5統計學方法

采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 5.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，免疫組織化學AOD值及transwell的相對熒光強度分別用單因素方差分析（one way-ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1VERO細胞及原代臍靜脈內皮細胞生長狀態良好（見圖1）

2.2HTNV感染的VERO和HUVEC鑒定及病毒滴度測定

HTNV感染72 h后幾乎所有的VERO細胞均被感染，HUVEC在HTNV感染72 h后也被感染，陰性對照組均無熒光。Reed-Muench法測定病毒的TCID 50為6.31×106/ml。

2.3DMP1在HUVEC的表達情況

免疫細胞化學檢測顯示DMP1可以表達在HUVEC；HTNV感染可以導致其表達的輕微上升；感染細胞加入TNF-α后DMP1的表達量顯著升高（P=0.009）；單獨TNF-α刺激對DMP1的表達量無顯著性影響，見圖2和表1。

2.4DMP1、TNF-α對HTNV感染的HUVEC的通透性影響

DMP1和TNF-α均可顯著提高HTNV感染的HUVEC的通透性（見圖3A，3B），且兩者聯合作用后，感染HUVEC的通透性進一步增加，與單獨作用比較差異有統計學意義（見圖3C，3D）。而DMP1，TNF-α單獨作用對于通透性的影響明顯低于HTNV感染組（見圖3A，3B）。如表2所示，HTNV單獨作用并不能提高HUVEC的通透性。

圖1　細胞培養結果

圖2　DMP1在HUVEC的表達變化

表1　各組DMP1表達變化 （）

表1　各組DMP1表達變化 （）

組別TNF-α（+）HTNV（-）　0.147±0.019　0.169±0.018 HTNV（+）　0.168±0.014　0.174±0.014 TNF-α（-）

表2　各組通透性變化情況 （）

表2　各組通透性變化情況 （）

組別DMP1+TNF-α HTNV（-）　573±60　713±78　759±162　735±78 HTNV（+）　557±76　1113±254　985±149　1426±283空白組TNF-α DMP1

確定DMP1可以表達在HTNV感染的HUVEC后，筆者進一步檢測DMP1和TNF-α對HTNV感染的HUVEC通透性的影響。結果顯示，DMP1和TNF-α均可顯著提高HTNV感染的HUVEC的通透性（P=0.000），且兩者聯合作用后感染HUVEC的通透性進一步增加，與單獨作用比較差異有統計學意義（與HTNV+TNF-α組比較，P=0.002，與HTNV+DMP1組比較，P=0.000）。而DMP1，TNF-α單獨作用對于通透性的影響遠遠低于HTNV感染組分別為（P=0.033和0.000）。HTNV單獨作用并不能提高HUVEC的通透性。見圖3和表2。

圖3　Transwell技術檢測HUVEC的通透性

3　討論

HTNV的主要靶細胞是血管內皮細胞和單核巨噬細胞，在病毒侵入人體后不久，機體產生細胞和體液免疫應答，參與HFRS的發病過程。TNF-α是主要由單核巨噬細胞和血管內皮細胞等產生的一種調節機體免疫和代謝過程的多功能細胞因子，是機體免疫防御、炎癥損傷和休克等發生的重要介質。TNF-α在體內維持一定濃度對機體發揮生理功能有重要作用，但血中濃度過高，則可能會對機體造成損害，已有研究證實，HFRS患者中的TNF-α的水平增高且與疾病進程密切相關［3］。HFRS基本的病理生理改變為全身微血管損傷，通透性增加，而TNF-α又可進一步增加血管的通透性。然而TNF-α引起通透性增高的具體機制鮮有報道。

DMP1是一種非膠原蛋白，近年來發現其表達十分廣泛，在腎、腦、腫瘤組織等均有表達［8］。有研究證實，DMP1能通過激活其伴侶MMP9降解基底膜的IV膠原等成分，基底膜是一種特化的細胞外基質，是細胞間物質轉移的物理屏障［9］。本文證實，DMP1可以表達在HTNV感染的血管內皮細胞，這說明DMP1可能在HFRS的發病中扮演一定角色。HTNV單獨作用于HUVEC并不能引起通透性增高，病毒感染細胞加入TNF-α之后，DMP1的表達量顯著增加。DMP1可以活化重組人基質金屬蛋白酶前體-9并增強MMP-9酶解活性，通過破壞局部組織結構降解基底膜屏障，改建細胞外基質，使通透性增加［9］。故筆者推測在HFRS的發病過程中，TNF-α通過促進DMP1表達增加促使通透性增高。

進一步的實驗證實，DMP1和TNF-α均可使體外HTNV感染的單層血管內皮細胞的通透性增加，且兩者聯合作用對通透性的增高作用明顯高于各自獨立作用，差異有統計學意義。TNF-α可以促進血管內皮鈣黏蛋白VE-cadherin的磷酸化、內化，并可以促進血管內皮生長因子VEGF和MMP-9的表達［10］。血管內皮鈣黏蛋白是內皮細胞間黏著連接的主要成分［11］，鈣黏蛋白的內化會導致黏著連接的解體，細胞間隙增大，這可能是TNF-α引起通透性增高的一方面原因。另一方面，TNF-α可以促進MMP-9的表達［10］，而DMP1可以激活MMP-9，兩者可能聯合參與了降解基底膜的過程從而使通透性大大增加，實驗結果中DMP1和TNF-α的共同作用使HTNV感染的HUVEC通透性增加明顯，顯著高于單獨作用組，也支持這一推斷。

綜上所述，本文通過免疫細胞化學技術實驗證明DMP1可以表達在HTNV感染的HUVEC，且進一步實驗證明TNF-α和DMP1在可以促進HTNV感染的血管內皮細胞通透性增加，且兩者存在聯合作用，該結果為闡明TNF-α引起通透性增高的機制提供實驗數據支持，MMP-9在HFRS中的直接作用將在接下來的實驗中進行研究。

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（張蕾編輯）

Function of DMP1 and TNF-αin hemorrhagic fever of renal syndrome*

Dong-sha Shi1，Yan-ying Dong1，Li-hua Zhao2，Ming Xie1
（1.Department of Immunology and Pathogenic Biology，School ofMedicine，Xi'an Jiaotong University，Xi'an，Shaanxi 710061，China；2.Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，Shaanxi710061，China）

Objective To exp lore the mechanism of hyper-permeability in hemorrhagic fever of renal syndrome（HFRS）.M ethods Immunocytochemistry was used to detect the production of dentin matrix protein 1（DMP1）.The penetrability changes of human umbilical vein endothelial cells were detected by transwell monolayer system. Uninfected vein endothelial cells were used as the negative control in each experiment.Immunofluorescence was used to guarantee that cells were infected by HTNV before each experiment.Results HTNV infection alone did not change the penetrability of vein endothelial cells.but the penetrability elevated remarkably after TNF-αor DMP1 were added，and increased evenmore when both two were added.Conclusions TNF-αand DMP1 can increase the penetrability of HTNV infected endothelial cells，and there were combined effects.They may play a role in the immunopathogenesis of HFRS.

hemorrhagic fever of renal syndrome；transwellmonolayer system；penetrability

R 373.32

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.007

1005-8982（2016）12-0030-05

2015-12-02

陜西省科技計劃項目基金資助課題（No：2012SF2-12）