生殖支原體16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測的比較研究*

唐正宇，王碧玉，蔡亮，謝良伊，姚玲，王太林

（1.長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410100；2.湖南省疾病預(yù)防控制中心；3.湖南省人民醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

論著

生殖支原體16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測的比較研究*

唐正宇1，王碧玉1，蔡亮2，謝良伊3，姚玲1，王太林1

（1.長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410100；2.湖南省疾病預(yù)防控制中心；3.湖南省人民醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

目的對生殖支原體（Mg）16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測結(jié)果進行比較，選取敏感度更高的靶基因進行TaqMan熒光PCR檢測。方法選取Mg 16SrRNA基因和MgPa基因為靶基因，根據(jù)已報道文獻設(shè)計合成特異性擴增引物和探針，對泌尿生殖道拭子標(biāo)本進行TaqMan熒光PCR檢測，對Mg不同靶基因TaqMan熒光PCR檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR檢測敏感性為90%，MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測敏感性為97.5%。結(jié)論MgPa基因TaqMan熒光PCR敏感性要高于16SrRNA基因TaqMan熒光PCR。

生殖支原體；16SrRNA基因；M gPa基因；TaqM an熒光聚合酶鏈反應(yīng)

生殖支原體（mycoplasma genitalium，Mg）是支原體的一種，由TULLY等于1981年從男性非淋菌性尿道炎（nongonococcal urethritis，NGU）患者尿道分泌物中分離出來，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的能夠自我復(fù)制的最小原核細胞型微生物［1］。在男性NGU中的感染率可達21%～45%［2-4］，2009年歐洲NGU治療指南已明確Mg是NGU病原體之一［2］。目前Mg難以培養(yǎng)，臨床標(biāo)本分離率低，血清學(xué)試驗與其他支原體存在較強的交叉反應(yīng)，在實際檢測中存在很大局限性。常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對臨床標(biāo)本中Mg的檢測缺乏定量評估，針對MgPa和16SrRNA兩個靶基因?qū)崟r熒光定量PCR技術(shù)在Mg檢測方面得到一定的應(yīng)用，但國內(nèi)外沒有對這兩種基因TaqMan熒光PCR檢測結(jié)果對比的文獻報道，難以選擇優(yōu)勢基因用于TaqMan熒光PCR檢測，本研究對同一批臨床標(biāo)本根據(jù)已報道的文獻針對16SrRNA基因和MgPa基因設(shè)計引物和探針進行Mg的核酸檢測，對兩種檢測結(jié)果進行比較研究，選取敏感度更高的靶基因作為TaqMan熒光PCR檢測方法，用于臨床上Mg感染者基因快速、準確的診斷。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1Mg標(biāo)準菌株來源Mg G-37標(biāo)準株由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所惠贈。

1.1.2標(biāo)本來源中南大學(xué)湘雅醫(yī)院皮膚性病就診患者、湖南省人民醫(yī)院檢驗科泌尿生殖道拭子標(biāo)本246例。患者同時行淋球菌、解脲脲原體、衣原體性病常規(guī)檢查均為陰性。經(jīng)常規(guī)Mg 16SrRNA基因PCR檢測為陽性40例，并經(jīng)核酸測序證實；陰性標(biāo)本206例。

1.1.3主要試劑及儀器Qiamp DNA mini kit（德國QIAGEN公司），Hot Star DNA taq酶、dNTP mixture、Platinum Taq DNA polymerase（美國Invitrogen公司），PCR nucleotide mix、Nuclease-free water（美國Promega公司），PCR產(chǎn)物純化試劑盒（美國Omega公司）。實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司7300型）。

1.2方法

1.2.1引物探針設(shè)計根據(jù)JESEN［5］等文獻設(shè)計引物、探針。引物和探針委托Invitrogen生物工程公司合成。見表1、2。

1.2.2Mg DNA的提取拭子標(biāo)本及標(biāo)準菌液的DNA提取使用德國QIAGEN公司的Qiamp DNAmini kit試劑盒，具體操作參照試劑盒說明書進行，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　TaqMan熒光PCR中針對MgPa基因的引物及探針

表2　TaqMan熒光PCR中針對16SrRNA基因的引物及探針

1.2.3MgPa基因TaqMan熒光PCR總反應(yīng)體系25μl，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：1×PCR反應(yīng)液，3.5 mmol/L氯化鎂 MgCl2，200 mmol/L dNTP，0.625 U DNAtaq酶，1.0 mmol/L正向引物MgPa-335 F，1.0 mmol/L反向引物MgPa-432R，0.1mmol/L探針Mg-Pa-380，5μl DNA模板，ABI 7300型實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃、1min，95℃、10min，1個循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火1min，共50個循環(huán)。每個反應(yīng)板設(shè)立標(biāo)準菌株陽性對照和陰性對照組。

1.2.4Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR總反應(yīng)體系50μl，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：1×PCR反應(yīng)液，5 mmol/L氯化鎂 MgCl2，200 mmol/L dNTP，1.25U DNA taq酶2.0mmol/L正向引物My-ins，2.0 mmol/L反 向引物 MGSO-2，0.1mmol/L探針Mgen-P1，4μl DNA模板。ABI7300型實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃、2min，95℃、10min，1個循環(huán)，95℃變性15 s，66℃退火1min，共60個循環(huán)。每個反應(yīng)包括陽性對照和陰性對照組。

2　結(jié)果

2.1MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測結(jié)果

對246例泌尿生殖道拭子標(biāo)本進行檢測，MgPa基因TaqMan熒光PCR擴增陽性為45例，與常規(guī)16SrRNA基因PCR檢測結(jié)果比較陽性符合率為97.5%（39/40），陰性符合率為97.1%（200/206），總符合率為97.2%（239/246）。

2.2Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR檢測結(jié)果

對同一批246例臨床標(biāo)本檢測，Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR擴增陽性為38例，與常規(guī)16SrRNA基因PCR檢測結(jié)果比較陽性符合率為90.0%（36/40），陰性符合率為99.0%（204/206），總符合率為97.6%（240/246）。

從檢測結(jié)果中筆者發(fā)現(xiàn)，3種PCR中都為陽性的有36例標(biāo)本。有3例標(biāo)本為常規(guī)16SrRNA基因PCR和MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測都為陽性的。僅MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測和Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR檢測為陽性的有2例。但有4份標(biāo)本僅是MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測為陽性的，經(jīng)再次檢測后仍為陽性。通過檢測結(jié)果比較，MgPa基因TaqMan熒光PCR敏感性（97.5%）要高于16SrRNA基因TaqMan熒光PCR（90%）。見附圖。

附圖　Mg 16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測結(jié)果比較

3　討論

YOSHIDA等［6］于2002年發(fā)表第一個實時PCR檢測Mg的報道。EDBERG［7］和JURSTRAND［8］等報告顯示，與傳統(tǒng)的16SrRNA基因PCR比較，實時的16SrRNA基因的PCR的敏感性較低。JURSTRAND等［8］文獻里指出男性泌尿生殖道標(biāo)本Mg實時PCR檢測與常規(guī)PCR比較，敏感性為72.2%，特異性為99.7%。

在本研究中對Mg 16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測結(jié)果進行比較。根據(jù)最新文獻檢測報道，采集泌尿生殖道拭子標(biāo)本要優(yōu)于首段尿標(biāo)本，其敏感度更顯著，故本研究中采集的標(biāo)本為泌尿道拭子。對246例臨床標(biāo)本進行MgPa基因和16SrRNA基因的Taqman熒光PCR檢測結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，MgPa基因TaqMan熒光PCR敏感性要高于16SrRNA基因TaqMan熒光PCR，MgPa基因Taq-Man熒光PCR證實是最敏感的方法。在筆者的比較研究中，實時16SrRNA基因PCR在試驗中需要4μl DNA模板，而實時MgPa基因的PCR在試驗中需要5μl DNA模板，這可能與16SrRNA作為實時PCR檢測的靶基因敏感性較低有關(guān)。MgPa基因作為實時PCR的靶基因更適合臨床Mg的診斷，能為今后開展人群中Mg的感染調(diào)查、定量分析Mg感染量與臨床表現(xiàn)的關(guān)系及開展耐藥監(jiān)測提供依據(jù)。

［1］DORMAN C J.Regulation of transcription by DNA supercoiling in Mycoplasma genitalium；global control in the smallest known self-replicating genome［J］.Mol Microbiol，2011，81（2）:302-304.

［2］SHAHMANESH M，MOI H，LASSAU F，et al.2009 European guideline on the of male non-gonococcal urethritis［J］.Int J STD AIDS，2009，20（7）:458-464.

［3］MOI H，REINTON N，MOGHADDARA A.Mycoplasma genitalium is associated with symptomatic and asymptomatic non-gono coccal urethritis in men［J］.Sex Transm Infect，2009，85（1）:15-18.

［4］COX C，MCKENNA J P，WATT A P，et al.Ureaplasma parvum and mycoplasma genitalium are found to be significantly associated with microscopy-confirmed urethritis in a routine genitourinary medicine setting［J］.Int JSTD AIDS，2015，16:DOI: 10.1177/0956462415597620.

［5］JENSEN J S，BJ?RNELIUS E，DOHN B，et al.Use of TaqMan 5'nuclease real-time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic［J］.J Clin Microbiol，2004，42:683-692.

［6］YOSHIDA T，DEGUCHI T，ITO M，et al.Quantitative detection of mycop lasma genitalium from first-pass urine of men with urethritis and asymptomaticmen by real-time PCR［J］.J Clin Microbiol，2002，40（4）:1451-1455.

［7］EDBERG A，JURSTRAND M，JOHANSSON E，et al.comparative study of three different PCR assays for detection of mycoplasma genitalium in urogenital specimens from men and women［J］.J Med Microbiol，2008，57（3）:304-309.

［8］JURSTRAND M，JENSEN JS，F(xiàn)REDLUND H，et al.Detection of mycoplasma genitalium in urogenital specimens by real-time PCR and by conventional PCR assay［J］.Journal of Medical Microbiology，2005，54:23-29.

（張蕾編輯）

Com parative study of TaqM an fluorescence PCR assay detection of m ycop lasma genitalium by 16SrRNA gene and M gPa gene*

Zheng-yu Tang1，Bi-yu Wang1，Liang Cai2，Liang-yi Xie3，Ling Yao1，Tai-lin Wang1
（1.Changsha Health Vocational College，Changsha，Hunan 410100，China；2.Hunan provincial Center for Disease Control and Prevention，Changsha，Hunan 410005，China；3.Hunan People's Hospital，Changsha，Hunan 410005，China）

Objective To compare the TaqMan fluorescence PCR detection results betweenmycoplasma genitalium 16SrRNA gene and MgPa gene.Methods Mycoplasma genitalium 16SrRNA gene and MgPa gene were selected as target genes.According to the reported literatures，the specific amp lified primers and probes were designed and synthesized.Urinary tract swab specimens were detected by TaqMan fluorescent PCR.The results of TaqMan fluorescence PCR detection of different target genes of Mycop lasma genitalium were statistically analyzed.Results The detection sensitivity of 16SrRNA gene and MgPa gene ofmycoplasma genitalium TaqMan PCR was 90%and 97.5%，respectively.Conclusions The sensitivity of TaqMan PCR in the genitalmycoplasma MgPa gene is higher than that of the 16SrRNA gene.

mycoplasma genitalium；16SrRNA gene；MgPa gene；TaqMan fluorescence PCR

R 446.5；R 375；

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.009

1005-8982（2016）12-0041-03

2016-02-17

湖南省教育廳科研基金項目（No：14C0090）