微小RNA Let-7/Lin28調節環與鼻咽癌血管新生的關系研究

李鵬

（湖北省襄陽市中心醫院 耳鼻喉科，湖北 襄陽 441021）

論著

微小RNA Let-7/Lin28調節環與鼻咽癌血管新生的關系研究

李鵬

（湖北省襄陽市中心醫院 耳鼻喉科，湖北 襄陽 441021）

目的探討微小RNA Let-7/Lin28調節環與鼻咽癌促血管生成因子的關系，并研究這一關系的作用機制。方法選取2012年4月-2014年在湖北省襄陽市中心醫院耳鼻喉科就診的鼻咽癌患者54例。另選取同期40例慢性鼻炎患者和32例健康者作為對照組。采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測組織中Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA相對表達量，ELISA檢測血清中血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）及內皮抑素（ES）水平，蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表達情況，分析m iRNA Let-7a/Lin28調節環與血管新生因子的關系。結果RT-PCR檢測發現鼻咽癌患者Lin28A m iRNA和Lin28B miRNA相對表達量均高于慢性鼻炎組和健康對照組（P＜0.05），而Let-7amiRNA的相對表達量低于上述兩組（P＜0.05）；ELISA檢測結果發現鼻咽癌患者組VEGF、bGFG、ES表達量均高于慢性鼻炎組和健康對照組（P＜0.05）；Western blot檢測發現鼻咽癌患者組病理組織中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表達量高于慢性鼻炎患者組和健康對照組（P＜0.05），而p-PTEN表達量低于上述兩組（P＜0.05）；相關性分析發現，Lin28A、Lin28B m iRNA與VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相關（P＜0.05），Let-7a m iRNA與VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈負相關（P＜0.05）。結論miRNA Lin28/Let-7調節環與血管新生有定的關聯性，而這一關聯性可能與激活Ras/PI3K/PTEN/Akt通路有關。

Lin28A；Lin28B；Let-7a；促血管生成因子；H-Ras/PTEN/PI3K/Akt

鼻咽癌是我國南方較為常見的一種惡性腫瘤，采用調強放療為主的綜合治療可以取得較為理想的效果［1］。但是臨床發現，鼻咽癌診斷時多處在晚期，且出現淋巴轉移。因此早診斷、早治療是鼻咽癌患者延緩生存期的重要前提保證［2］。miRNA Let-7家族在惡性腫瘤中表達下降，而Lin28A、Lin28B則升高。目前，已有臨床報道證實［3］，miRNA Let-7/Lin28與鼻咽癌的發生、發展有一定的關聯性，而癌癥的發生、發展，尤其是淋巴轉移與血管新生有著密切關系。那么鼻咽癌患者miRNA Let-7/Lin28與血管新生是否具有相關性以及這一相關性的作用機制如何值得研究［4］。本研究旨在探討miRNA Let-7/Lin28與促血管生成因子的關聯性，以及這一關系的作用機制，以期揭示miRNA與鼻咽癌淋巴轉移的關系，進而為分子的靶向治療提供一定的實驗基礎依據。

1　資料與方法

1.1研究對象

選擇2012年4月-2014年在湖北省襄陽市中心醫院耳鼻喉科就診的鼻咽癌患者54例。所有患者經病理組織活檢證實為鼻咽癌，其中，男性43例，女性11例，年齡33～69歲，平均（47.1±6.9）歲。根據中國鼻咽癌臨床分期委員會“2008年鼻咽癌分期診斷標準”將54例患者分為：初診患者40例，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期13例；14例出現淋巴轉移。另選取72例疑有腫瘤患者，經病理組織活檢分為慢性咽炎患者和健康者并作為對照組。慢性咽炎組：40例，其中，男性31例，女性9例，年齡32～68歲，平均（46.5±6.4）歲。健康對照組：32例，其中，男性25例，女性7例，年齡34～70歲，平均（47.3±6.8）歲。所有患者均簽訂知情同意書，并經醫院倫理委員會同意批準執行。

1.2方法

1.2.1病理標本收集所有研究對象在局部麻醉下行內鏡輔助鼻咽活檢術，取部分所采集病理組織標本以多聚甲醛固定進行病理學檢查，其余組織放入已消毒的離心管，置入液氮中，于-80℃冰箱中冷凍保存備用。

1.2.2血清標本采集所有研究對象在入選后均采取空腹肘靜脈血3m l并立即分離血清，置于-40℃冰箱冷凍中備用，統一測定。

1.2.3實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA將冷凍活檢的部分鼻咽組織以液氮吹打使細胞破裂，Trizol法抽提細胞中的總RNA，采用紫外分光光度計判定RNA的純度并以λ260 nm的光吸收值作為定量，逆轉錄合成cDNA作為PCR模板，設計靶基因Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA以及內參U6snRNA的正反向引物（引物的正反序列見表1），以cDNA模板合成引物，進行PCR反應，瓊脂糖電泳進行有效性驗證，將有效的 cDNA模板、Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA以及內參U6snRNA進行RT-PCR，嚴格按照SYBR Green（TOYOBO公司，日本）說明書進行操作，在LightCyclerTM（Roche公司）PCR儀上進行擴增反應，數據分析采用2-△△Ct求得目的基因相對于內參基因的相對表達量。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。△△Ct表示正常鼻咽組織與鼻咽癌組織中差異程度。

1.2.4血管新生指標檢測檢測的血管新生指標有血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及血管內皮抑素（Endostatin，ES）。采用酶聯免疫法（ELISA）進行檢測，嚴格執行說明書操作。

1.2.5蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測H-Ras/ PTEN/PI3K/Akt通路將冷凍活檢的部分鼻咽組織取出，通入液氮研磨使細胞充分破裂，將破碎的組織裝入玻璃混勻器中，按照100（1/10 ng加入適量裂解液，含PMSF），冰上孵育30min，然后4℃離心機，以12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存備用。組織總蛋白經考馬斯亮藍進行定量。組織蛋白質樣品加入1/4倍量5×SDS上樣緩沖液進行混勻，煮沸變性6 min左右，10% SDS-PAGE115V進行電泳，210mA恒流1 h 40min濕轉至硝酸纖維膜（NC膜）上。5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉 3 h，加抗 H-Ras-21、PTEN、p-PI3K、p-Akt單抗（鼠抗人，1∶500）。TBST洗膜3次，每次10min，然后與結合辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10 min，最后采用發光試劑盒ECL反應，X膠片曝光顯影。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，數據用單因素方差分析，Western blot圖片用Image J4.2進行掃描灰度值。用pearson相關性分析指標相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1　引物序列

2　結果

2.1RT-PCR檢測結果

研究結果顯示，鼻咽癌患者Lin28A miRNA、Lin28B miRNA相對表達量均高于慢性鼻炎組、健康對照組（P＜0.05），而Let-7a miRNA的相對表達量低于上述兩組（P＜0.05），見表2。

2.2血管新生因子測定結果

血清研究結果顯示，鼻咽癌患者組VEGF、bGFG、ES表達量均高于慢性鼻炎組、健康對照組（P＜0.05），見表3。

2.3Western blot檢測結果

檢測結果顯示，鼻咽癌患者組病理組織中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表達量高于慢性鼻炎患者組、健康對照組（P＜0.05），而p-PTEN表達量低于上述兩組（P＜0.05），見表4和附圖。

表2　RT-PCR檢測Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA相對量的結果比較 （）

表2　RT-PCR檢測Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA相對量的結果比較 （）

注：1）與健康對照組比較，P＜0.05；2）與慢性鼻炎組比較，P＜0.05

組別Let-7amiRNA健康對照組　32　2.23±0.61　2.21±0.43　1.49±0.31慢性鼻炎組　40　2.75±0.56　3.49±0.691）　1.27±0.291）鼻咽癌組　54　3.64±0.872）　4.58±0.762）　0.83±0.242）F值　10.41　21.36　8.93 P值　0.019　0.000　0.027例數Lin28AmiRNA Lin28BmiRNA

表3　不同組別血管新生因子結果比較 （）

表3　不同組別血管新生因子結果比較 （）

注：1）與健康對照組比較，P＜0.05；2）與慢性鼻炎組比較，P＜0.05

ES/（ng/L）健康對照組　32　25.47±6.13　12.65±2.89　31.69±4.65慢性鼻炎組　40　31.32±9.601）　19.20±3.531）　32.32±6.31鼻咽癌組　54　50.43±10.122）　30.33±4.182）　76.62±6.332）F值　19.47　10.71　8.83 P值　0.000　0.014　0.031組別例數VEGF/（pg/ml）bFGF/（pg/ml）

表4　Western blot檢測H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白灰度值比情況比較 （）

表4　Western blot檢測H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白灰度值比情況比較 （）

注：1）與健康對照組比較，P＜0.05；2）與慢性鼻炎組比較，P＜0.05

組別p-Akt健康對照組 0.345±0.023 0.462±0.017 0.126±0.015　0.107±0.013慢性鼻炎組0.449±0.0311）0.298±0.0211）0.212±0.0201）0.237±0.0191）鼻咽癌組　0.824±0.0442）0.253±0.0242）0.351±0.0272）0.428±0.0262）F值　13.58　18.32　12.36　19.38 P值　0.010　0.009　0.011　0.007 H-Ras p-PTEN p-PI3K

附圖　Western b lot檢測H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表達情況

表5　相關性分析結果

2.4相關性分析

表5相關性分析顯示，Lin28A、Lin28B miRNA與VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相關（P＜0.05），與p-PTEN呈負相關（P＜0.05）；Let-7a miRNA與VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈負相關（P＜0.05），與p-PTEN呈正相關（P＜0.05）。

3　討論

鼻咽癌是我國南方較為常見的一種惡性腫瘤，采用調強放療為主的綜合治療方法是目前非常有效的方式之一，但是該病隱匿性較高、轉移傾向較為強烈，大約有75%的患者發現鼻咽癌時在晚期，其局部已發生淋巴結轉移，因此盡早診斷是臨床治愈該病的關鍵點［5］。臨床研究結果顯示［6］，該病與編碼區基因有關，其非編碼區基因與鼻咽癌的發生發展有一定的聯系，特別是一類高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，約有50%左右的miRNA定位于腫瘤相關基因區域，染色體出現異常時miRNA的基因拷貝數出現變化，研究證實［7］miRNA參與了腫瘤發生發展的每一個環節。有報道指出miRNA經過長期保存、反復凍融后仍然可以穩定存在，其在腫瘤患者循環中的表達譜相對于正常人具有顯著性差異［8］。因此miRNA具有穩定、不易降解、高效、易得等特點，可以作為腫瘤標志物。在多種人類癌癥中，Let-7 miRNA家族的表達發生明顯的改變，其調控多種癌相關基因表達情況，具有“抑癌基因”的功能［9］。Lin28是廣泛表達于惡性腫瘤細胞中的RNA結合蛋白，研究證實其為Let-7生物合成的重要負向調節因子，也有研究證實，Lin28反過來成為Let-7的主要作用靶點，兩者構成了調控癌癥發生發展的“雙向負反饋調節環”［10］。黃孝文等［4］已經有研究證實，鼻咽癌患者組織中存在Lin28表達上調，而Let-7a表達下調。本研究也證實鼻咽癌患者組織中存在Lin28A、Lin28B均出現上調，而Let-7a出現下調，與黃孝文所研究的基本一致。這也說明鼻咽癌患者存在Lin28/Let-7調節環的表達異常。但需要指出的是黃等并未探討Lin28/Let-7調節環與血管新生的關系以及關聯性的作用機制。

惡性腫瘤的主要臨床特征表現在癌細胞容易侵襲周圍組織以及發生遠處轉移，而其轉移主要是通過新生血管和淋巴管進行轉移［11］。新生血管已經被證實為腫瘤細胞的轉移通道，其中VEGF和bFGF是促血管新生作用最強且特異性最高的兩種因子，具有促進血管內皮細胞增殖、遷移，從而促進新生血管的形成，而新生血管的形成為癌細胞的轉移提供通道以及營養支持，進一步促進癌細胞的增殖和擴散［12］。通過本研究顯示，鼻咽癌患者血清中VEGF、bFGF的表達量高于慢性鼻炎組、健康對照組。促血管生成與抗血管生成共同構成一個復雜的網絡體系。研究顯示［13］，ES增高的惡性腫瘤患者出現遠處轉移增加的現象，其原因是ES的增高間接的反映出血管新生因子的表達量也明顯增加，因此本研究也發現，鼻咽癌患者血清中ES含量明顯高于慢性鼻炎組、健康對照組。

Lin28/Let-7調節環影響多種基因、蛋白的表達，主要有C-myc基因、Ras基因、高遷移率組蛋白等。有研究發現［14］，H-Ras的過表達與鼻咽癌的發生、發展密切相關。有研究顯示，Ras可以通過Raf//MEK/ ERK和PI3K/PTEN/Akt等通路介導腫瘤的發生、發展，而PI3K/PTEN/Akt通路是目前公認的血管新生通路，該通路上的PI3K、Akt蛋白出現磷酸化后將導致VEGF、bFGF等促血管生成因子的高表達［15］。通過Western blot證實鼻咽癌患者組織中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表達量高于慢性鼻炎患者組、健康對照組，而p-PTEN表達量低于上述兩組，該結果說明鼻咽癌患者PI3K/PTEN/Akt被激活，導致促血管生成因子高表達。通過pearson相關性分析發現，Lin28A、Lin28B miRNA與 VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相關，Let-7a miRNA與VEGF、bFGF、HRas、p-PI3K及p-Akt呈負相關，該結果說明Lin28/ Let-7對鼻咽癌患者PI3K/PTEN/Akt及其下游的促血管生成因子有一定的影響。通過本研究顯示，Lin28/Let-7與促血管生成因子具有一定的關聯性，而該關聯性可能是由于PI3K/PTEN/Akt通路被激活所致。

綜上所述，miRNA Lin28/Let-7調節環與血管新生有定的關聯性，而該關聯性可能與激活PI3K/ PTEN/Akt通路有關。

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（張蕾編輯）

Relationship between m iRNA Let-7/Lin28 feedback loop and nasopharyngeal angiogenesis

Peng Li
（Department of ENT，Xiangyang Central Hospital，Xiangyang，Hubei 441021，China）

Objective To investigate the relationship betweenm iRNA Let-7/Lin28 feedback loop and nasopharyngeal pro-angiogenesis factors，and to study themechanism of its effect.Methods From April 2012 to 2014，54 cases of nasopharyngeal carcinoma（NPC）therapied in ENT in Xiangyang Central Hospital were selected，and 40 cases of chronic rhinitis patients and 32 healthy subjects were selected as control groups.Expressions of Lin28A，Lin28B and Let-7amiRNA relative were detected by RT-PCR，and the levels of VEGF，bFGF and ES in serum were detected by ELISA.Expressions of protein in H-Ras/PTEN/PI3K/Akt pathway were detected by western blotting，and relationship between miRNA Let-7a/Lin28 feedback loop and angiogenesis factors was analyzed.Results Expression levels of Lin28A miRNA，Lin28B miRNA in NPC patients were relatively higher than the other two groups，and the relative expression of Let-7a miRNA was less than the other two groups（P＜0.05）.ELISA test found that expressions of VEGF，bGFG，ES in NPC patients were higher than the control groups（P＜0.05）.Expressions of H-Ras，p-PI3K and p-Akt in NPC patients pathology tissue were higher than the other two groups（P＜0.05），and expression of p-PTEN was less than the above two groups（P＜0.05）.The correlation analysis showed thatLin28A，Lin28BmiRNA were positively correlated with VEGF，bFGF，H-Ras，p-PI3K and p-Akt（P＜0.05），and Let-7am iRNA was negatively correlated with VEGF，bFGF，H-Ras，p-PI3K and p-Akt（P＜0.05）.Conclusions miRNA Lin28/Let-7 feedback loop has certain correlation with angiogenesis，and this associationmay related to the activation of Ras/PI3K/PTEN/Akt pathway.

Lin28A；Lin28B；Let-7a；angiogenic factor；H-Ras/PTEN/PI3K/Akt

R 739.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.010

1005-8982（2016）12-0044-05

2015-11-17