海洋枝頂孢霉BH0531對黃瓜根結線蟲防治的微生態效應

黃　敏，劉曉霞，申佩娟，蔡　爽，馮　欣，2，孟慶恒，2*，孫建華，2

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

海洋枝頂孢霉BH0531對黃瓜根結線蟲防治的微生態效應

黃敏1，劉曉霞1，申佩娟1，蔡爽1，馮欣1，2，孟慶恒1，2*，孫建華1，2

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

測定了海洋枝頂孢霉BH0531發酵液在室內離體條件下對根結線蟲的殺線效果，分析了盆栽試驗條件下對黃瓜根結線蟲指數、減退率及對土壤中微生物數量的影響。結果表明，發酵原液濃縮1倍時，其對根結線蟲的校正死亡率高達96.2%；蟲口減退率達到71.21%；發酵液對土壤中細菌和放線菌數量均有促進作用，細菌和放線菌數量分別最高達到1.24×108CFU/mL及1.56×106CFU/mL，而對真菌則表現出高濃度時的抑制作用，高濃度組真菌由原來的3.12×104CFU/mL減少至8.67×103CFU/mL；隨著時間的延長，促進作用減弱，但對真菌的抑制作用未減弱。菌株BH0531發酵液可通過殺線作用、促進細菌和放線菌生長、以及降低土壤真菌化程度等微生態效應來實現對黃瓜根結線蟲病的防治作用。

海洋枝頂孢霉；黃瓜根結線蟲；線蟲減退率；土壤微生物；微生態效應

植物寄生線蟲是一類重要的植物病原物，其所造成的經濟損失可高達1 570億美元每年［1］。其中的根結線蟲（Meloidogynespp.），因其分布廣、寄主多，危害也最為嚴重，對植物根結線蟲病害的防治也更受重視［2］。由于化學農藥殘留時間長、毒性大，且與環境友好的要求相悖，所以逐漸受到限制。生物防治也就成為關注的熱點，并且已經取得一定的研究成果，如已經上市并得到應用的淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）生防制劑和阿維菌素等［3-4］。區別于上述菌種，海洋來源的枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531是一株具有殺線蟲活性的絲狀海洋真菌［5］，研究表明，其代謝物產物具有水溶性好、分子質量小、熱穩定性好等特點［5-6］；該菌在實驗室條件下對人工培養的松材線蟲和根結線蟲均顯示出較好的殺線活性［7］。

土壤中的根結線蟲指數和土壤微生物是植物根結線蟲病害發生過程中兩個重要的微生態生物要素。土壤微生物可以代表土壤中物質代謝的旺盛程度，是土壤肥力的一個重要指標，能反映植物和微生物對土壤物質積累的貢獻，但又土壤各方面因素的影響［8］。在有機質的礦化、腐殖質的形成和分解、植物營養元素的轉化等過程中起著不可替代的作用［9］。張婷等［10］將枯草芽孢桿菌Bacillus sub-tilisB006與淡紫擬青霉（P.lilacinus）Str.NH-PL-03施用于設施黃瓜連作土壤中，發現根際土壤由“真菌型”病土向“細菌型”健康土轉變。尹淑麗等［11］通過施用不同生防菌研究了黃瓜不同生育時期根際土壤中微生物數量的動態變化，結果表明，接種細菌D和放線菌317的處理可提高根際土壤中細菌的數量，降低真菌的數量，對放線菌數量的影響不明顯。這些證據表明運用菌株發酵液來影響植物根系土壤微生態環境是可行的。因此，本實驗設計并實施了以根結線蟲和微生物為檢測對象的黃瓜盆栽試驗，采用傳統的稀釋平板法計數土壤中三大類微生物，淘洗-過篩-蔗糖離心法分離土壤根結線蟲并計算蟲口減退率，旨在探明海洋枝頂孢霉BH0531對土壤根結線蟲指數和土壤微生物的微生態效應，為進一步的應用研究提供實驗依據，并為開發具有自主知識產權的新型安全殺線蟲生物制劑提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1供試菌株和材料

海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531，菌種保藏號CGMCC-5445，由天津師范大學生命科學學院微生物實驗室提供；黃瓜根結線蟲（Meloidogynespp.）二齡幼蟲J2：取自天津市寶坻區黃瓜大棚基地；供試黃瓜品種為新津春四號：天津市黃瓜研究所。

1.1.2培養基

（1）活化培養基：去皮馬鈴薯200 g/L煮汁，20 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂。

（2）發酵培養基：去皮馬鈴薯200 g/L煮汁，20 g/L葡萄糖，pH值自然。

（3）大麥仁培養基：10 g大麥仁，8 mL去離子水，浸泡3～6 h，滅菌。

（4）牛肉膏蛋白胨培養基：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，20 g/L瓊脂，pH 7.4～7.6。

（5）馬丁孟加拉紅培養基：5g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖，1g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，3.3g/L孟加拉紅，20g/L瓊脂，pH值自然。

（6）改良高氏一號培養基：20 g/L可溶性淀粉，0.5 g/L NaCl，1 g/L KNO3，0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L FeSO4·7H2O，20 g/L瓊脂，pH 7.2～7.4。

1.1.3化學試劑

葡萄糖：天津市鳳傳化學試劑有限公司；瓊脂：天津市珠海衛生材料廠；孟加拉紅、牛肉膏、可溶性淀粉：天津市化學試劑一廠；蛋白胨：浙江玉環紅星生化制品廠；NaCl：天津市塘沽化學試劑廠；KH2PO4：天津市化學試劑六廠；FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O：西安化學試劑廠；KNO3：天津市化學試劑三廠。實驗所用主要化學試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設備廠；Leica DME光學顯微鏡：上海徠卡顯微系統有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HZ-2010K控溫搖瓶柜：上海欣蕊自動化設備有限公司；YXQG02型電熱式滅菌鍋：山東新華醫療器械廠；LDS-10離心機：北京醫用離心機廠。

1.3試驗方法

1.3.1發酵濾液的制備

BH0531菌株的活化：將保藏的BH0531菌種接種至活化培養基斜面試管，26℃培養5～7 d。

種子液的制備：取新培養的菌株斜面，加入無菌水洗下孢子，制備成106個/mL的孢子懸液。

發酵液的制備：以2%接種量接入裝有100 mL液體發酵培養基的500 mL三角瓶中。26℃、120 r/min培養4 d。將培養好的菌液1 000 r/min離心去菌體，再經孔徑為0.22 μm微孔濾膜真空抽濾，即為發酵濾液。

1.3.2黃瓜根結線蟲二齡幼蟲（J2）懸浮液的制備

將大田取得的黃瓜病根剪成1 cm小段；在1%次氯酸鈉溶液中漂洗4min，再在勻漿機里攪拌2min；利用100目、300目和500目的網篩沖洗并收集蟲卵。再將卵收集到的離心管中，在底部加入40%蔗糖溶液，3 500 r/min密度梯度離心5 min。之后吸取界面溶液過500目網篩，反復沖洗收集卵。將上述收集得到的卵置于已消毒的培養皿中，墊上濕潤濾紙，25℃條件下孵化4 d。

1.3.3發酵液處理對黃瓜栽培土壤中根結線蟲指數和減退率的影響實驗

將黃瓜籽消毒催芽后，在穴盤中育苗，待黃瓜苗長至兩葉一心期時定植。所用土壤為大田土∶泥炭土∶沙子=4∶4∶1。移栽后每盆使用發酵液40 mL灌根處理，1 d后接入配制好的線蟲懸浮液。將所獲發酵液配制成以下3個濃度梯度：原液稀釋一倍、原液、原液濃縮一倍（對應干物質含量分別為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL），并按表1處理進行實驗，每個處理重復3次，共24盆，隨機排列。分別于處理15 d后計算線蟲減退率。

表1 試驗設計與處理Table 1 Design and treatment of experiments

1.3.4分析測定方法

（1）殺線率的測定

將所獲發酵原液分別稀釋和濃縮1倍，以無菌水為對照，以黃瓜根結線蟲（J2）為靶標，進行殺線蟲活性測定。取96孔板，每孔加入靶標線蟲懸液20 μL（約200條），再分別加入200 μL發酵液的原液、1倍稀釋液、1倍濃縮液，每個處理3次重復，25℃條件下培養，分別于3 d和5 d后于顯微鏡下觀測線蟲死亡情況，線蟲校正死亡率計算公式如下：

（2）線蟲減退率

土壤根結線蟲分離采用淘洗-過篩-蔗糖離心法［12-13］。線蟲減退率計算公式如下［14-15］：

（3）不同處理土壤中可培養微生物的測定

采用傳統的稀釋平板法測定可培養微生物數量，細菌培養采用牛肉膏蛋白胨培養基，真菌培養采用馬丁孟加拉紅培養基（臨用前每300 mL加入25%的乳酸3～4滴），放線菌培養采用改良高氏一號培養基（臨用前每100 mL加入1%重鉻酸鉀1 mL）。微生物計數均計3個重復。每毫升樣品中菌落形成單位數=同一稀釋度3次重復的平均菌落數×稀釋倍數×5［16］。

1.3.5數據處理

應用Origin8.0軟件對結果進行統計分析。

2　結果與分析

2.1發酵液殺線活性的測定

以無菌水作為對照（CK），對不同濃度的BH0531菌株發酵液進行了殺線蟲活性的測定，結果見表2。由表2可知，在給定質量濃度范圍內，發酵液對根結線蟲二齡幼蟲都具有明確的殺線活性，其作與濃度呈正相關；其中濃縮一倍的發酵液殺線率最高，3 d和5 d的校正死亡率分別達到93.7%和96.2%，均在A級（殺線率≥90%）以上。結果表明，3 d和5 d之間的殺線活性并無顯著差異，但線蟲死亡率呈現出持續升高的現象，表明發酵液的殺線活性具有時間延續性，并維持在較高的水平。

表2　菌株BH0531不同濃度發酵液對根結線蟲二齡幼蟲的殺線活性Table 2 The nematicidal activity of strain BH0531 different concentration fermentation liquid on root-knot nematodes J2

2.2發酵液對土壤中根結線蟲指數的影響

以無菌水作為對照（CK），土壤中根結指數和線蟲減退率于處理后第15天進行了測定，結果見表3。由表3可知，施藥15 d后，3個濃度梯度處理條件下土壤線蟲數明顯減退，尤其是2個較高濃度條件下的線蟲減退率＞50%，分別達到66.67%和71.21%。這一結果同表2結果有一致性，即殺線活性與發酵液的質量濃度呈正相關。相對而言，對照實驗的線蟲數不但沒有減退，反而略有增加，說明土壤中根結線蟲的減退是發酵液作用的結果，進一步明確了BH0531菌株發酵液對根結線蟲的防治作用。

表3　生物殺線劑對土壤根結線蟲二齡幼蟲的防治效果Table 3 Control effect of bio-nematicide on root-knot nematode J2

2.3BH0531發酵液對土壤中可培養微生物數量的影響

2.3.1對根際土壤中可培養細菌數量的影響

圖1　發酵液處理20 d（A）及50 d（B）對土壤細菌數量的影響Fig.1 Effect of fermentation liquid treatment 20 d（A）and 50 d（B）on amount of bacteria in soli

由圖1（A）可知，處理20 d后的土壤中未加線蟲組土壤中的細菌數量整體上呈現遞增趨勢，表明發酵液對細菌數量有一定的促進作用。與未加線蟲組相比，加線蟲組細菌數量明顯減少，說明線蟲的存在與細菌數量之間存一定的負相關性。由圖1（B）可知，處理50 d后的土壤中細菌數量整體少于處理20 d后數量，其中1倍濃縮液處理50 d時加線蟲組的細菌數量較處理20 d土壤細菌數量減少了41.44%。此外，加線蟲組土壤細菌數量雖然整體上低于未加線蟲組，但在組內（與對照相比）仍然呈現出隨著發酵液濃度的提高而增加的趨勢，特別是20 d的測定結果更加明顯，且加線蟲組與未加線蟲組組內均存在顯著性差異（P＜0.05）。盡管發酵液處理50 d后，高濃度（1倍濃縮液）處理的細菌數量有所降低，但仍較同組對照高出43.37%。這種時間上的減退效應可能與營養物的消耗和高濃度條件下導致線蟲高死亡率所產生的物質有關。因此，發酵液在整體上對土壤中細菌的數量具有促進作用。

2.3.2對根際土壤中可培養放線菌數量的影響

由圖2可知，未加線蟲組土壤中的放線菌數量均比加線蟲組數量多，50 d時加線蟲組與未加線蟲組細菌數量存在差異顯著性（P＜0.05）。這一結果與細菌的測定結果相一致，在對照組中，未加線蟲組土壤比加線蟲組土壤放線菌數量分別增加為52.78%和53.27%。處理50d和20d后的土壤放線菌數量加線蟲組合未加線蟲組差異不顯著（P＜0.05）。值得注意的是發酵液對放線菌的促進作用未表現出明確的濃度梯度相關性。同時，發酵液對放線菌數量的影響同樣存在著時間上的減退效應。

圖2　發酵液處理20 d（A）及50 d（B）對土壤放線菌數量的影響Fig.2 Effect of fermentation liquid treatment 20 d（A）and 50 d（B）on amount of actinomycetes in soli

2.3.3對根際土壤中可培養真菌數量的影響

由圖3可知，發酵液處理50 d后的土壤中真菌數量顯著少于處理20 d后真菌數量并且同樣觀察到時間效應。不同的是發酵液對土壤真菌數量顯示出高濃度抑制效應。發酵液處理20 d后，隨著發酵液濃度的提高，加線蟲組土壤真菌數量也隨之增加；而未加線蟲組的土壤真菌數量在高濃度時卻出現了負增長（-33.72%），明顯不同于細菌和放線菌的結果。發酵液處理50 d后，高濃度發酵液表現出對真菌的抑制作用。尤其是未加線蟲組在整體上低于加線蟲組真菌數量，明確表現出對土壤真菌數量的抑制作用，且未加線蟲組處理20 d和50 d之間存在差異顯著性（P＜0.05）。

圖3　發酵液處理20 d（A）及50 d（B）對土壤真菌數量的影響Fig.3 Effect of fermentation liquid treatment 20 d（A）and 50 d（B）on amount of fungus in soli

3　結論

海洋來源的枝頂孢霉（Acremniumsp.）BH0531是一株以松材線蟲為靶標篩選出的生防菌，其一倍濃縮液對根結線蟲的殺線率也達到了A級以上，具有較高的殺線活性。研究結果表明，菌株BH0531發酵液在室內離體條件下，對根結線蟲的殺線作用拿到對土壤中的微生物數量和類群有明顯的影響，表現出對細菌和放線菌的促進作用，以及對土壤真菌的抑制作用。因此，菌株BH0531發酵液可以通過使根際土壤由“真菌型”病土向“細菌型”健康土轉變，以實現對植物“促長、防病”的作用。雖然可培養微生物占土壤微生物總量的比例不足1%［17］，但土壤中可培養微生物可能是對土壤生態系統貢獻最大的類群。

此外，菌株BH0531發酵液對土壤根結線蟲指數有明顯的控制效應，在兩個較高濃度條下的線蟲減退率分別達到66.67%和71.21%，可以有效提高線蟲減退率，降低蟲口密度，拮抗因線蟲的存在導致的土壤微生物數量降低，從而實現對黃瓜根結病的防治作用。充分表明該菌株是很有發展前途的線蟲生防因子，為防治黃瓜根結線蟲病、發展無公害蔬菜開辟一條新道路。當然，菌株BH0531發酵液能否從根本上改善連作土壤中微生物群落結構變化，使連作土壤中有益微生物增多，有效控制線蟲指數，以及在規模栽培條件下防效如何還需要進一步探究驗證。

［1］金娜，劉倩，簡恒，等.植物寄生線蟲生物防治研究新進展［J］.中國生物防治學報，2015，31（5）：789-800.

［2］劉維志.植物病原線蟲學［M］.北京：中國農業出版社，2000.

［3］高淋淋，劉志明.植物根結線蟲生物防治研究進展［J］.廣西植保，2015，28（1）：32-35.

［4］王磊.阿維菌素面臨的機遇與挑戰［J］.生物技術世界，2015（2）：62-64.

［5］MENG Q H，SHI X X.Isolation of anAcremoniumsp.from a screening of 52 seawater fungal isolates and preliminary characterization of its growth conditions and nematicidal activity［J］.Biotechnol Lett，2012，34（10）：1847-1850.

［6］蒙春蕾，王勇勇，黃敏，等.不同氮源對海洋真菌BH0531發酵液殺線蟲活性的影響［J］.江蘇農業科學，2015，43（5）：121-123.

［7］杜海霞，蒙春蕾，王勇勇，等.海洋枝頂孢霉BH0531代謝產物對松材線蟲形態和酶活的影響［J］.中國釀造，2014，33（6）：23-26.

［8］張成娥，劉國彬，陳小利.坡地不同利用方式下土壤微生物和酶活性以及生物量特征［J］.土壤通報，1999，30（3）：101-103.

［9］龐新，張福鎖，王敬國.不同供氮水平對根際微生物量及微生物活度的影響［J］.植物營養與肥料學報，2000，6（4）：321-327.

［10］張婷，李世東，廖作清.“秸稈降解生防菌強化技術”對黃瓜連作土壤微生物區系的影響［J］.中國生態農業學報，2013，21（11）：1416-1425.

［11］尹淑麗，麻耀華，張麗萍，等.不同生防菌對黃瓜根際土壤微生物數量及土壤酶活性的影響［J］.北方園藝，2012（1）：10-14.

［12］毛曉芳，李輝信，陳小云，等.土壤線蟲三種分離方法比較［J］.生態學雜志，2004，23（3）：149-151.

［13］LIU W Z.Plant nematology［M］.Beijing：China Agricultural Press，2000.

［14］孫建華，宇克莉，陳宏，等.Sr18真菌代謝物防治根結線蟲病研究［J］.華北農學報，2002，17（1）：119-123.

［15］孫建華，齊軍山，馮欣，等.Sr18生物殺線蟲制劑防治黃瓜根結線蟲病研究［J］.華北農學報，2005，20（4）：74-78.

［16］沈萍，陳向東.微生物學實驗［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［17］ELLIS R J，MORGAN P，WEIGHTMAN A J，et al.Cultivation-dependent and-independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal-contaminated soil［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69（6）：3223-3230.

Micro-ecological effects of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 on control of cucumber root-knot nematode

HUANG Min1，LIU Xiaoxia1，SHEN Peijuan1，CAI Shuang1，FENG Xin1，2，MENG Qingheng1，2*，SUN Jianhua1，2
（1.College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin 300387，China）

Thein vitronematicidal efficiency of fermentation liquid of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 on root-knot nematode was determined.The effects of potting experimental conditions on the index and decreasing rate of nematodes and microorganism amount in soli were analyzed.The results showed that when the fermentation liquid was concentrate 1 time，the corrected death rate of the root-knot nematode was up to 96.2%，and the decreasing rate of nematodes was 71.21%.The fermentation liquid had promoting effect of bacteria and actinomycetes count in the soil，and bacteria and actinomycetes count were 1.24×108CFU/ml and 1.56×106CFU/ml，respectively.But it had inhibiting effect on fungus at high concentration，and the amount of fungus was decreased from 3.12×104CFU/ml to 8.67×103CFU/ml.However，the promoting effect decreased as time went by，but the inhibiting effect was undiminished.The control effect of strain BH0531 fermentation broth on cucumber root-knot nematode was effective by micro-ecological effects，such as nematicidal effect，promoting the growth of bacteria and actinomycetes，decreasing amount of fungus in soli and so on.

marine-derivedAcremoniumsp.；cucumber root-knot nematode；decreasing rate of nematode；soil microorganism；micro-ecological effects

Q939.9；S432.4+5

0254-5071（2016）03-0052-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.012

2016-01-05

國家自然科學基金資助項目（31272019）；天津市自然基金聯合項目（15JCYBJC51400）

黃敏（1990-），女，碩士研究生，研究方向為微生物的活性物質。

孟慶恒（1963-），男，副教授，研究方向為應用微生物。