野生蟬花與發酵菌絲體揮發性化合物分析

衛亞麗，劉愛英，呂 昱，湯洪敏，*（.貴州民族大學化學與環境科學學院，貴州少數民族醫藥資源開發與利用重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學農學院，貴州貴陽550025；.貴州大學真菌資源研究所，貴州貴陽550025）

野生蟬花與發酵菌絲體揮發性化合物分析

衛亞麗1，2，劉愛英3，呂 昱1，湯洪敏1，*
（1.貴州民族大學化學與環境科學學院，貴州少數民族醫藥資源開發與利用重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學農學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學真菌資源研究所，貴州貴陽550025）

為研究不同提取方法對野生蟬花與發酵菌絲體揮發性化合物種類及含量的影響，首先通過ITS基因序列分析、菌落及產孢結構的形態特征對菌株GZU1205241進行鑒定。然后通過頂空固相微萃取（HS-SPME）和水蒸氣蒸餾對野生蟬花和發酵菌絲體的揮發性化合物進行提取，并利用氣相色譜-質譜（GC-MS）對兩者揮發性化合物進行了測定。結果表明，菌株GZU1205241為蟬棒束孢菌。野生蟬花和發酵菌絲體分別含有56和58種揮發性物質，其中25種為共有物質。野生蟬花主要以酸類（90.08%）物質為主，其中油酸的相對含量達到了45.09%，棕櫚酸的含量為21.18%，亞油酸的含量為9.44%。發酵菌絲體中主要也以酸類物質（86.57%）物質為主，其中棕櫚酸的相對含量達到了38.44%，亞油酸的相對含量達到了18.58%，油酸的相對含量為12.83%。兩種方法獲得的野生蟬花及發酵菌絲體的揮發性成分種類及相對含量上有明顯差別，水蒸氣蒸餾法鑒定出的揮發性成分較多，而頂空固相微萃取鑒定出的揮發性成分比較少。但不論是蒸氣蒸餾法還是頂空固相微萃取，野生蟬花及發酵菌絲體的揮發性成分都是以脂肪酸為主。

蟬花，揮發性化合物，頂空固相微萃取，氣相色譜-質譜聯用，蟬棒束孢

蟬花Cordyceps cicadae又稱大蟲草、金蟬花、蟬茸、蟲花等，是蟬若蟲感染蟬擬青霉菌（Paecilomyces cicadae）后形成的蟲生真菌。現代藥理學研究表明，蟬花能增強機體免疫調節功能［1］，改善腎功能［2-3］，抑菌［4-5］，抗腫瘤［6-8］、抗病毒、抗輻射、抗疲勞、抗應激、抗氧化、抗驚厥［9］等。對于蟬花及蟬棒束孢活性物質的研究，主要集中在多糖［10］、氨基酸、核苷［11-12］、蟲草酸等方面，對其他次生代謝產物，如麥角甾醇、脂肪酸、多球殼菌素［13］等研究較少。目前對野生蟬花和發酵菌絲體的揮發性物質研究未見報道，而從藥食用真菌揮發性物質中鑒定分離藥理活性物質，提取香精香料，通過研究天然揮發性化合物形成機制研制新的揮發性物質生物催化劑等已成為一個新興的并且具有廣泛商業前景的研究領域。

揮發性成分的提取多采用傳統水蒸汽蒸餾法（HD）及頂空-固相微萃取法（HS-SPME）。目前，尚未見水蒸汽蒸餾法（HD）及頂空-固相微萃取法用于蟬花及菌絲體揮發性成分的研究報道。為了更系統地了解蟬花及菌絲體所含的揮發性成分，本文采用液體發酵技術對蟬棒束孢菌株進行培養，獲得蟬棒束孢菌菌絲體；進一步采用揮發油提取器、頂空固相微萃取（HS-SPME）結合氣相色譜-質譜（GC-MS）法確定野生蟬花與發酵菌絲體的揮發性物質組成，希望對從野生蟬花和菌絲體中分離鑒定新的或有價值的揮發性物質提供重要的理論意義；同時，對野生蟬花和菌絲體中揮發性物質進行比較，以期對研究野生蟬花和菌絲體中揮發性物質組成差異提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生蟬花 購自浙江中藥材市場，經貴州大學真菌資源研究所鑒定為蟬花；菌株 采用組織分離法從野生新鮮蟬花中分離、純化獲得蟬棒束孢菌株（編號GUF1205241）；正己烷 色譜純，默克；氯化鈉 分析純，天津市科密歐化學試劑開發中心；馬鈴薯培養基PDA、莎氏培養基SDA、察氏培養基CDA 杭州百思生物技術有限公司。

試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；Agilent 7890A/5975C氣-質聯用儀 美國安捷倫公司；SB-100DT型超聲波清洗儀 濟南天華超聲電子儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 液體發酵

將活化后的菌種接種至裝有100 mL液體培養基的300 mL三角瓶中，置恒溫恒濕培養箱中，28℃培養7 d，然后按10%的接種量轉接至1 L三角瓶中。28℃恒溫恒濕條件下靜置培養15 d。過濾得發酵菌絲體，用清水洗滌3次，干燥，粉碎，制得液體發酵菌絲體樣品。

1.3 形態學觀察

1.3.1 菌落形態 將沙氏SDA、查氏CDA及PDA三種固體培養基制成平板，以點植法接種已經活化的蟬棒束孢菌種，即用接種針尖蘸取少量孢子點植在平板的中心位置，然后于28℃恒溫培養箱中倒置培養，

14 d后觀察并描述。

1.3.2 菌絲體及孢子形態觀察 采用乳酸石炭酸棉藍染色法對菌絲體及孢子進行染色，采用蔡氏數碼顯微鏡進行觀察照相。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 菌株的形態觀察及鑒定 將觀察記載的宏觀特征和微觀產孢結構特征，參照Browm&Smith和Samson的分類系統進行經典的分類。

1.4.2 菌株的ITS基因序列測定及分子系統發育樹的構建 DNA提取、基因擴增采用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（100次量）及Premix Taq

Version 2.0（Loading dye mix）試劑盒；DNA測序由上海英俊生物技術有限公司進行；測序獲得的序列導入Mega 5.2中進行比對后，人工進行修正保存為fasta格式文件［14］比對后的序列用Mega 5.2程序的MP建樹，經1000次bootstrap驗證。

1.5 野生蟬花、菌絲體揮發性成分分析

1.5.1 水蒸氣蒸餾法 取干燥的野生蟬花及菌絲體粉末，稱取10 g，加300 L水浸泡2 h，參照《中國藥典》2010年版一部附錄XD揮發油測定法（甲法）提取。得到淡黃色油狀物，用1 mL乙酸乙酯萃取，經無水硫酸鈉干燥24 h后進行測定。

1.5.2 頂空固相微萃取法 分別將2 g野生蟬花、菌絲體樣品放置在20 mL的頂空瓶中，加入2 g NaCl和8 mL經過煮沸冷卻的蒸餾水，搖勻，用具有聚四氟乙烯墊的密封蓋密封，將老化后的60 μm PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于80℃吸附40 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250℃解吸3 min，用于GC-MS分析檢測。在萃取前，將萃取頭在氣相色譜進樣口250℃活化10 min。

1.6 氣質聯用GC-MS分析

1.6.1 儀器 Agilent 7890A/5975C氣-質聯用儀，色譜柱：HP-FFAP，25 m×0.32 mm×0.25 μm。

1.6.2 氣相色譜條件 采用不分流進樣，進樣口溫度250℃；載氣為氦氣，流速1 mL/min。程序升溫條件：40℃保留5 min后，以5℃/min上升到100℃，再以10℃/min，上升到150℃保留5 min，最后6℃/min升至230℃保留10 min。

1.6.3 質譜條件 接口溫度250℃，EI離子源，電離能為70 eV，電離源溫度為230℃，掃描范圍：50～550。

2 結果與分析

2.1 菌落的形態特征

圖1 GUF1205241菌株在三種不同培養基上的菌落形態Fig.1 Strains colony morphology on the three different medium

從圖1可以看出，菌株都能在三種固體培養基上生長，菌株在PDA固體培養基上的直徑最大，生長速度最快，其次在莎氏培養基上生長較快，在察氏培養基上的生長速度最慢。三種固體培養基上的菌落正面基本為白色，呈厚厚的絨毛狀，背面培養基的顏色都有淡淡黃色，在SDA和PDA培養基上，菌落表面呈同心環，且整個菌落致密、平展，凸起部分有厚厚孢子粉，邊緣為全緣。

2.2 菌株產孢結構

圖2 GUF1205241菌株的分生孢子及分生孢子梗Fig.2 The conidium and conidium terrier of strains GUF1205241

從圖2可以看出，菌株GUF1205241瓶狀小梗有兩型，即基部膨大的瓶形和基部不膨大的披針形，頂端皆具拉長的、偏離主軸的細管，瓶狀小梗上溢出干燥的向基性分生孢子鏈，分生孢子內具油滴，分生孢子壁光滑、透明，兩端皆稍尖細，腰微收，呈擬卵圓形、柱形及梭形，這些特征與Samson（1974）的描述相近似。

2.3 菌株系統發育分析

圖3 GZU1205241菌株和相似屬的一些種基于rDNA ITS-5.8S-ITS2序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on analysis of rDNA ITS-5.8S-ITS2 sequences of GZU1205241 and some related species

從GenBank中進行BLAST下載相似度大于95%的種以及一些形態相似的種共13個菌株，以Mariannaea camptospora為外群，用ClustalX 1.83軟件進行多序列比對，用MEGA 5.2軟件最大簡約法（MP）構建系統發育樹（圖3）。從樹圖看出菌株GZU1205241與蟬棒束孢以100%的支持率聚在一起。綜合菌株的菌落特征、產孢結構特征及系統發育分析將菌株GUF1205241鑒定為蟬棒束孢Isaria cicadae Miq.。

2.4 野生蟬花及發酵菌絲體揮發性成分分析

2.4.1 水蒸氣蒸餾法 野生蟬花和菌絲體的揮發性成分GC-MS總離子流圖見圖4，通過NIST08譜庫檢索，野生蟬花中共鑒定出56種揮發性物質，發酵菌絲體中鑒定出58種揮發性物質，具體見表1。

圖4 野生蟬花（A）和發酵菌絲體（B）揮發性化合物總離子流色譜圖（水蒸氣蒸餾）Fig.4 Total ion chromatograms for the volatile components identified Cordyceps cicadae（A）and mycelia（B）of Isaria cicadae by steam distillation

從表1可以看出，野生蟬花中鑒定出56種揮發性化合物中含有醇（4種）、烷（18種）、烯（8種）、酮（4種）、醛（4種）、酸（12種）、酯（3種）等物質，主要以酸類（90.08%）物質為主，其中油酸的相對含量達到了41.48%，棕櫚酸、亞油酸、十四酸、棕櫚油酸、硬脂酸的相對含量分別為21.18%、9.44%、3.57%、3.20%、2.13%。其次是烷類、醇類、烯類化合物，分別占4.42%、2.64%、2.13%。酯類、酮類、醛類及其他化合物分別占0.64%、0.35%、0.10%、0.28%。

發酵菌絲體中58種揮發性化合物含有烷（20種）、烯（4種）、酮（2種）、酸（12種）、酯（9種）、萘（3種）、酚（2種）、醛（4種）、其他（2種）等揮發性物質，其中要以酸類（86.57%）物質為主，其中棕櫚酸的相對含量達到了38.44%，亞油酸的相對含量達到了18.58%，油酸的相對含量達到了12.83%。十五烷酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、硬脂酸的相對含量分別為4.22%、4.19%、3.92%、2.28%；其次為酯類化合物（7.71%），酯類化合物中含量最高的是鄰苯二甲酸二異辛酯（6.46%）；烷類、酚類、醛類、烯類、其他、酮類、萘類相對含量分別為3.50%、0.73%、0.63%、0.63%、0.50%、0.10%、0.08%。

表1 野生蟬花及菌絲體揮發性化合物GC-MS分析Table1 Volatile compounds in Cordyceps cicadae Shing and cultured mycelia of Isaria cicadae analysed by GC-MS（steam distillation）

續表

綜上所述，水蒸氣蒸餾提取的揮發性的成分較多，野生蟬花及發酵菌絲體揮發性成分主要以酸類物質為主，兩者共有物質有25種。

2.4.2 頂空固相微萃取 野生蟬花和菌絲體的揮發性成分GC-MS的總離子流圖見圖5，野生蟬花中共鑒定出22種揮發性物質。發酵菌絲體中鑒定出23種揮發性物質（頂空固相微萃取）見表2。

從表2可以看出，野生蟬花中鑒定出22種揮發性化合物，主要以酸類（83.62%）物質為主，其中油酸的相對含量為18.98%，除此之外，還含有棕櫚酸（16.73%）、苯甲酸（6.81%）、壬酸（5.33%）、豆蔻酸（5.30%）、7-十六碳烯酸（5.12%）、庚酸（4.61%）、己酸（4.25%）、辛酸（4.11%）、癸酸（3.88%）、亞油酸（3.85%）、月桂酸（2.82%）、十五烷酸（2.44%）、乙酸（0.13%）。其次為酮（5.32%）、酚（4.70%）、酯（2.38%）、其他（2.22%）。發酵菌絲體中23種揮發性化合物含有烷（1種）、酮（5種）、酸（11種）、酯（1種）、酚（3種）、醛（2種）等揮發性物質，其中要以酸類（86.51%）物質為主，其中棕櫚酸的相對含量達到了42.18%，油酸的相對含量為11.46%，亞油酸的相對含量為15.13%；硬脂酸、棕櫚油酸、十四烷酸、十五酸的相對含量分別為4.23%、3.51%、2.44%、2.05%；其次為酮類化合物（7.94%），酚類化合物（2.59%），醛（1.67%）。

圖5 野生蟬花（A）和發酵菌絲體（B）揮發性化合物總離子流色譜圖（固相微萃取）Fig.5 Total ion chromatograms for the volatile components identified Cordyceps cicadae（A）and mycelia（B）of Isaria cicadae by HS-SPME

表2 野生蟬花及菌絲體揮發性化合物GC-MS分析（頂空固相微萃取）Table2 Volatile compounds in Cordyceps cicadae Shing and cultured mycelia of Isaria cicadae analysed by GC-MS（HS-SPME）

續表

3 討論

3.1 提取方式對揮發性成分的種類及相對含量的影響

采用水蒸氣蒸餾法及頂空固相微萃取獲得的野生蟬花及發酵菌絲體的揮發性成分種類及相對含量上有明顯差別，水蒸氣蒸餾法鑒定出的揮發性的成分較多，而頂空固相微萃取鑒定出的揮發性的成分比較少。可能由于水蒸氣蒸餾法溫度較高，頂空固相微萃取溫度較低，而且萃取的物質種類受萃取頭類型的影響較大，理想的固相微萃取頭類型還有待于進一步研究。但不論是蒸氣蒸餾法還是頂空固相微萃取，野生蟬花及發酵菌絲體其揮發性成分都是以脂肪酸為主。采用水蒸氣蒸餾法分析，野生蟬花中脂肪酸類物質占90.08%，發酵菌絲體中脂肪酸類物質相對含量占86.57%；采用頂空固相微萃取分析，野生蟬花中脂肪酸類物質相對含量占83.62%，發酵菌絲體中酸類物質的相對含量占86.51%。這表明兩種方法所得提取物的組成及各成分的相對百分含量均存在一定差異，因此，只有將兩種方法合起來，才能得到對產品的揮發性物質的綜合評價。

3.2 野生蟬花及發酵菌絲體揮發性成分比較

野生蟬花及發酵菌絲體中揮發性成分都以脂肪酸類物質為主，但是脂肪酸的種類及相對含量不同。野生蟬花中油酸的相對含量最高達到了41.48%，其次為棕櫚酸、亞油酸、十四酸、棕櫚油酸、硬脂酸，相對含量分別為21.18%、9.44%、3.57%、3.20%、2.13%。發酵菌絲體中棕櫚酸的相對含量最高達到了38.44%，其次為亞油酸，相對含量為18.58%，油酸的相對含量為12.83%。十五烷酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、硬脂酸的相對含量分別為4.22%、4.19%、3.92%、2.28%。因此，不論是野生蟬花還是發酵菌絲體揮發性成分都是以脂肪酸類物質為主，野生蟬花中不飽和脂肪酸的含量高于發酵菌絲體中不飽和脂肪酸的含量。發酵菌絲揮發性成分的種類及相對含量受培養基種類及培養條件的影響較大，利于不飽和脂肪酸產生的培養基的種類及培養條件還有待于進一步的研究。

脂肪酸特別是不飽和脂肪酸有多種生物活性，不飽和脂肪酸具有降低血脂中的甘油三酯和抗氧化、抗自由基、抗腫瘤、增強免疫的作用，其含量越高越易阻止血栓形成。不論是野生蟬花還是發酵菌絲體揮發性成分中不飽和脂肪酸的含量較高，其與蟬花藥理作用之間的相關性有待于進一步研究。除脂肪酸類物質外，在野生蟬花和發酵菌絲體揮發性成分中發現了一些可以作為香料的物質，可能與蟬花的香味有關。這些物質大多為醛類或酮類。例如：2-正戊基呋喃、甲基壬基甲酮、正己醛、壬醛、苯甲醛、反式-2，4-癸二烯醛、丁羥甲苯。苯甲醛為GB2760-2014規定為暫時允許使用的食用香料，主要用于配制杏仁、櫻桃、桃子、果仁等型香精，用量可達40%；也可以作為醫藥、染料、香料的中間體。壬醛用于配制人造玫瑰油和玫瑰型香精等，可用于食品，我國GB 2760-2014規定反式-2，4-癸二烯醛為允許使用的香料，主要用于配制雞肉香精。關于蟬花香味、生物活性的物質基礎及構效關系還有待于進一步的研究。

4 結論

菌株GZU1205241為蟬花的無性型蟬棒束孢。水蒸氣蒸餾法及頂空固相微萃取獲得的野生蟬花及發酵菌絲體的揮發性成分種類及相對含量上有明顯差別，水蒸氣蒸餾法鑒定出的揮發性的成分較多，而頂空固相微萃取鑒定出的揮發性的成分比較少。但不論是蒸氣蒸餾法還是頂空固相微萃取，野生蟬花及發酵菌絲體的揮發性成分都是以脂肪酸為主。因此，只有將兩種方法合起來，才能得到對產品的揮發性物質的綜合評價。野生蟬花和發酵菌絲體分別含有56種和58種揮發性物質，其中25種為共有物質，野生蟬花主要以酸類（90.08%）物質為主，其中油酸的相對含量達到了45.09%，棕櫚酸的含量為21.18%，亞油酸的含量為9.44%。發酵菌絲體中主要以酸類（86.57%）物質為主，其中棕櫚酸的相對含量達到了38.44%，9，12-十八碳二烯酸相對含量的達到了18.58%，油酸的相對含量達到了12.83%。

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Analysis of volatile compounds in Cordyceps cicadae and submergedly cultured mycelia of Isaria cicadae

WEI Ya-li1，2，LIU Ai-ying3，LV Yu1，TANG Hong-min1，*
（1.College of Chemistry and Environmental Science，Guizhou Minzu University，Key laboratory of Development and Using Medicine resources of Ethnic Minority Groups of Guizhou，Guiyang 550025，China；2.Institute of Agriculture，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.Institute of Fungus Resources，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

In order to determine the volatile compounds in Cordyceps cicadae and submergedly cultured mycelia of Isaria cicadae，the strain GZU1205241 was identified by the sequence analysis of a rDNAITS fragment and the traditional identification methods（morphological characteristics of the colony and sporulation structure）.Then the volatile compounds of wild Cordyceps cicadae mycelium and fermentation volatile compounds were extracted by headspace solid phase microextraction（HS-SPME）and steam distillation and determined by gas chromatography and mass spectrometry.The results showed that the strain GZU1205241was Isaria cicadae.Cordyceps cicadae and mycelia of Isaria cicadae，respectively，contained 56 and 58 volatile compounds.Hereinto，25 compounds in both wild and mycelia.The main volatile compounds of Cordyceps cicadae mainly were acids，and the relative content of oleic acid，hexadecanoic acid and linoleic acid was 45.09%，21.18%and 9.44%，respectively.The main volatile compounds of fermented mycelia were acids，and the relative content of palmitic acid，linoleic acid and oleic acid was 38.44%，18.58%and 12.83%，respectively.The volatile composition and relative content of wild Cordyceps Cicadae and fermented mycelia obtained by steam distillation and headspace solid phase micro extraction had obvious differences.The volatile composition were more by water vapor distillation.Acid were the main volatile compounds of Cordyceps cicadae and fermented mycelia obtained by steam distillation and headspace solid phase micro extraction.

Cordyceps cicadae；volatile compounds；HS-SPME，GC-MS；Isaria cicadae

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0078-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.007

2015－07－17

衛亞麗（1977-），女，博士，副教授，研究方向：資源昆蟲應用，E-mail：weiyali0012@163.com。

湯洪敏（1969-），女，教授，研究方向：生物化學，E-mail：echoboy99@163.com。

貴州省科技廳貴州民族大學聯合項目（黔科合J字LKM［2012］04）。