類固醇肌萎縮癥與上皮鈉通道表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

陸幸妍，翟玉瑩，陳　鑫，劉　洋，林曉文，陳　珺，楊國柱，盧　麗，李青南，黃　韌△

(1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；2.廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所/廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510633)

?

類固醇肌萎縮癥與上皮鈉通道表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

陸幸妍1，翟玉瑩1，陳鑫1，劉洋1，林曉文1，陳珺1，楊國柱1，盧麗1，李青南2，黃韌2△

(1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；2.廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所/廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510633)

目的基于類固醇肌萎縮癥(SMA)大鼠模型，分析大鼠骨骼肌萎縮與其上皮鈉通道蛋白(ENaC)表達(dá)的相關(guān)性，探討ENaC在SMA發(fā)病機(jī)制中的可能作用。方法將32只3個(gè)月齡雌性SD大鼠分為4組分別給藥：對照組(C組)每周4次肌內(nèi)注射生理鹽水；低頻給藥組(L組)、中頻給藥組(M組)和高頻給藥(H組)分別予以每周2、4、6次肌內(nèi)注射地塞米松(Dex)每次1.0 mg/kg。給藥4周停藥處死，取腓腸肌稱質(zhì)量，石蠟包埋制片，行蘇木精-伊紅(HE)染色形態(tài)學(xué)觀察，肌纖維橫截面積(FCSA)測量，以及糖皮質(zhì)激素受體(GR)和α-上皮鈉通道蛋白(α-ENaC)免疫組織化學(xué)檢測(IHC)及其相關(guān)性分析。結(jié)果(1)各給藥組大鼠體質(zhì)量和腓腸肌濕質(zhì)量均較C組下降，且有劑量依賴性。(2)各給藥組FCSA均較C組減少，且有劑量依賴性。(3)GR的M和H組積分光密度(IOD)值較C組增高；α-ENaC的L、M和H組IOD值較C組增高，且有劑量依賴性；GR和α-ENaC的IOD值變化呈正相關(guān)。結(jié)論GC誘導(dǎo)骨骼肌組織ENaC表達(dá)增高，可能與SMA的肌萎縮病變相關(guān)。

地塞米松；類固醇性肌萎縮；受體，糖皮質(zhì)激素；α-上皮鈉通道蛋白；免疫組織化學(xué)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)具有抗炎、抗過敏、抗休克等多種藥理作用，臨床上應(yīng)用廣泛。患者往往需要短期大量、長期甚至終生使用GC，其嚴(yán)重不良反應(yīng)之一是誘發(fā)骨和骨骼肌損傷。骨骼肌損傷以類固醇肌病(steroid myopathy，SM)最為常見，其主要臨床表現(xiàn)為肌無力和肌萎縮。氟化類固醇激素制劑[如地塞米松(Dex)]比非氟化制劑(如潑尼松龍)更易誘導(dǎo)SM[1]。SM分急性和慢性兩種類型，慢性SM也稱類固醇肌萎縮癥(steroid muscular atrophy，SMA)。本文前期研究發(fā)現(xiàn)：以Dex誘發(fā)大鼠糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松模型，其骨骼肌組織萎縮性病理特征明顯，且免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測結(jié)果顯示上皮鈉通道蛋白(ENaC)表達(dá)增加。ENaC是細(xì)胞膜上非電壓依賴型鈉離子(Na+)通道蛋白，介導(dǎo)Na+單向內(nèi)流從而維持離子代謝平衡。骨骼肌肌膜內(nèi)外Na+變化是影響動作電位傳遞的關(guān)鍵機(jī)制，且主導(dǎo)骨骼肌“興奮-收縮耦聯(lián)”的產(chǎn)生。據(jù)此推測，骨骼肌ENaC表達(dá)的變化可能與肌萎縮相關(guān)。本研究利用大鼠SMA模型探討兩者的相關(guān)性，為SM機(jī)制研究和藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料3個(gè)月齡SPF級雌性SD大鼠32只，體質(zhì)量(200±20)g[廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：syxk(粵)2008-0085]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，分為4組，如下給藥：對照組(C組)肌內(nèi)注射生理鹽水 1.0 mL/kg，每周4次；低頻給藥組(L組)、中頻給藥組(M組)和高頻給藥組(H組)分別每周2、4、6次肌內(nèi)注射Dex和磷酸鈉注射液(廣州白云山天心制藥股份有限公司，1 mL∶1 mg)1.0 mg/kg。連續(xù)給藥4周，停藥次日按動物實(shí)驗(yàn)規(guī)范麻醉、處死，取腓腸肌稱質(zhì)量。

1.2方法取大鼠左側(cè)腓腸肌，經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋及切片，用于以下檢測。

1.2.1腓腸肌切片形態(tài)學(xué)觀察和FCSA測量腓腸肌切片蘇木精-伊紅(HE)染色后，光鏡下觀察腓腸肌組織形態(tài)變化，并分別自100倍鏡下隨機(jī)選取100個(gè)肌纖維，用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)測量骨骼肌纖維橫截面積(FCSA)[單位：PPI(pixels per inch)]，計(jì)算各組肌纖維FCSA平均值。

1.2.2腓腸肌切片IHC檢測糖皮質(zhì)激素受體(GR)和α-ENaC 的表達(dá)以光鏡下可視棕黃色顆粒為IHC陽性反應(yīng)。在400倍下隨機(jī)選取15個(gè)視野，用Bioquant-Osteo圖像分析系統(tǒng)采圖，以IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描獲取陽性反應(yīng)區(qū)域積分光密度值(IOD)。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠體質(zhì)量變化C組大鼠隨生長時(shí)間延長而體質(zhì)量增加，顯示增加狀態(tài)無異常。與C組比較，H組給藥1周體質(zhì)量即明顯下降(Ρ<0.01)；L、M組自2周起明顯下降，且有劑量依賴性(Ρ<0.01，Ρ<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠腓腸肌濕質(zhì)量的變化C、L、M、H組腓腸肌濕質(zhì)量分別為(1.59±0.04)、(1.40±0.08)、(1.29±0.13)、(1.17±0.04)g。與C組比較，L、M和H組腓腸肌濕質(zhì)量依序下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，且有劑量依賴性。

表1　　各組大鼠不同時(shí)間體質(zhì)量比較±s，n=8)

a：Ρ<0.01，與C組比較；b：Ρ<0.01，與L組比較；c：Ρ<0.05，與M組比較。

A:C組；B：L組；C：M組；D：H組。

圖1腓腸肌的形態(tài)學(xué)觀察(光鏡，×100)

圖2　　α-ENaC和GR的IHC檢測及形態(tài)學(xué)觀察(光鏡，×400)

2.3各組大鼠腓腸肌病理組織學(xué)的變化

2.3.1形態(tài)學(xué)觀察光鏡下觀察可見，與C組比較，L、M和H組肌纖維大小不一且有不同程度的萎縮性病變征，即肌纖維間隙變窄、部分纖維呈“小角化”改變；未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤和肌纖維壞死及再生，見圖1。

2.3.2 FCSA的變化C、L、M、H組腓腸肌FCSA測量值(PPI)分別為1 303.83±32.22、936.32±14.75、768.82±18.56和777.40±17.80；L、M和H組的肌纖維橫截面積均較C組明顯減少(P<0.01)，L、M組有劑量依賴性，但M與H組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.3α-ENaC和GR的IHC檢測及分析α-ENaC的IHC分析顯示：各組肌纖維均見α-ENaC的棕黃色陽性反應(yīng)顆粒。IOD值分析顯示，L組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；M、H組與C組比較明顯增高，且H高于M組，呈劑量依賴性。GR的IHC分析顯示：各組肌纖維均見GR的棕黃色陽性反應(yīng)顆粒。IOD值分析顯示，L組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；M、H組與C組比較明顯增高，但M與H組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、3。

a：P<0.01；b：P<0.05。

圖3α-ENaC和GR的IOD值比較

2.3.4GR和α-ENaC在腓腸肌中表達(dá)的相關(guān)性分析GR和α-ENaC的IOD值相關(guān)性分析顯示，C、L、M和H組腓腸肌的α-ENaC與GR的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.176，P<0.01)。

3　討　　論

3.1SMA大鼠模型的建立SM分為急性和慢性兩種類型。急性SM一般出現(xiàn)在用藥后5～7 d內(nèi)，與激素用量及持續(xù)時(shí)間無直接關(guān)系，與個(gè)體易感性差異有關(guān)，其病理表現(xiàn)為大量肌纖維壞死、再生和吞噬現(xiàn)象及肌纖維萎縮，累及Ⅰ、Ⅱ型肌纖維。慢性SM又稱為SMA，可在用藥3～4周后發(fā)生，與激素用藥量和持續(xù)時(shí)間有關(guān)[1]，主要病變?yōu)檫x擇性Ⅱ型肌纖維萎縮，無明顯的肌壞死和再生。李建萍等[2]用Dex 5 mg/kg腹腔注射3 d建立SD大鼠急性SM模型，發(fā)現(xiàn)肌萎縮病變程度隨著注射劑量的增加或者用藥時(shí)間的延長而逐漸加重。本文以不同給藥頻率肌內(nèi)注射Dex 4周。結(jié)果顯示，隨給藥時(shí)間延長及頻率增加，大鼠體質(zhì)量和腓腸肌濕重下降呈劑量依賴性，與SMA肌萎縮的體征相符。同時(shí)，以肌內(nèi)注射Dex每次1.0 mg/kg，每周4次，可見腓腸肌纖維呈現(xiàn)SMA典型的萎縮性病理征。建模過程符合疾病動物模型制作原則[3]。

3.2SMA模型大鼠腓腸肌GR和α-ENaC的表達(dá)及其相關(guān)性分析IHC結(jié)果顯示，隨著Dex給藥頻率增加，腓腸肌切片F(xiàn)CSA減少，反映骨骼肌萎縮程度加重，且有劑量依賴性，為Dex的藥物效應(yīng)所然。生理性GC由腎上腺皮質(zhì)分泌，通過血液運(yùn)送至靶器官，與靶細(xì)胞內(nèi)GR結(jié)合調(diào)節(jié)糖、脂、蛋白質(zhì)等多種代謝功能。藥源性Dex可通過與靶細(xì)胞GR結(jié)合而產(chǎn)生藥效反應(yīng)。本研究低頻給藥Dex對GR表達(dá)水平未見顯著影響，可能來自外源性GC激活并競爭結(jié)合存量GR。隨著給藥頻率增加，GC誘導(dǎo)GR表達(dá)增高，但由于平臺效應(yīng)，以及垂體-丘腦-腎上腺軸的負(fù)反饋抑制作用增強(qiáng)，中、高頻給藥誘導(dǎo)GR表達(dá)增高但不體現(xiàn)劑量依賴性。與此相應(yīng)，α-ENaC表達(dá)隨Dex給藥頻率增加而增高，且有劑量依賴性，提示GC可能在通過肌細(xì)胞GR介導(dǎo)影響ENaC表達(dá)的同時(shí)，還通過其他代謝途徑間接誘導(dǎo)骨骼肌組織ENaC表達(dá)增高，其機(jī)制有待探討。

3.3外源性GC誘導(dǎo)骨骼肌ENaC表達(dá)增高與骨骼肌萎縮的關(guān)系最新研究已證實(shí)，骨骼肌肌膜上有ENaC表達(dá)[4]。本研究IHC檢測可見C組腓腸肌纖維有α-ENaC陽性反應(yīng)，與文獻(xiàn)結(jié)果相符。已知ENaC有α、β、γ和δ 4種亞基結(jié)構(gòu)。由α、β、γ的異源亞基構(gòu)成是構(gòu)建高效能ENaC通道所必需的。α亞基可以構(gòu)成同源性功能通道，β和γ亞基在通道復(fù)合體中主要起調(diào)節(jié)作用。δ亞基主要存在于大腦中，可能部分發(fā)揮α亞基功能[5-6]。本研究以α-ENaC表達(dá)水平反映ENaC的功能變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，腓腸肌組織α-ENaC增高與肌萎縮程度有劑量依賴性，且與GR表達(dá)呈正相關(guān)，提示Dex致骨骼肌萎縮，可能存在GR誘導(dǎo)ENaC表達(dá)增高影響骨骼肌收縮及肌蛋白代謝，并導(dǎo)致肌萎縮的信號機(jī)制。

Rich等[7]研究骨骼肌纖維肌膜去極化對肌纖維興奮性減退的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞外鉀離子(K+)升高使膜去極化后，肌纖維的興奮性減退，其動作電位的產(chǎn)生不再是“全或無”，且閾值升高、峰值降低。隨著去極化程度增加，當(dāng)靜息電位達(dá)到某一水平時(shí)，肌纖維的興奮性完全喪失，任何去極化的刺激都不能引起肌纖維的反應(yīng)。Na+是肌膜去極化的關(guān)鍵離子，有理由推測，肌膜ENaC高表達(dá)或活性增高引發(fā)Na+內(nèi)流，Na+升高使膜去極化，肌膜動作電位傳導(dǎo)阻滯，肌纖維興奮-收縮耦聯(lián)失調(diào)，產(chǎn)生功能性麻痹，即肌無力。此外，在生理?xiàng)l件下，ENaC可以通過調(diào)控Na+內(nèi)流調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓。沈頡飛等[8]將電極插入三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，觀察Na+內(nèi)流對細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié)及其對神經(jīng)-肌肉興奮耦聯(lián)中電壓門控Na+通道(VGSC)的影響，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)高滲導(dǎo)致VGSC失活，不能激發(fā)動作電位，提示ENaC表達(dá)增高或異常開放導(dǎo)致Na+內(nèi)流也可能使VGSC功能受損，阻礙動作電位傳導(dǎo)，導(dǎo)致功能性肌無力。

持續(xù)肌無力使骨骼肌處于失用狀態(tài)，可以激活A(yù)TP依賴性泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解蛋白質(zhì)[9-10]。Reid等[11]已證實(shí)在失重狀態(tài)下肌特異性F-box泛素蛋白酶及連接酶atrogin/MAFbx表達(dá)顯著上調(diào)。ENaC高表達(dá)導(dǎo)致持續(xù)的功能性肌無力可能構(gòu)成刺激信號，激活泛素-蛋白酶系統(tǒng)降解骨骼肌收縮蛋白，導(dǎo)致肌萎縮及器質(zhì)性肌無力。其次，肌無力下凋亡因子caspase3誘導(dǎo)肌細(xì)胞凋亡也能引起失用性肌萎縮[11]。

綜上所述，外源性GC可以誘導(dǎo)骨骼肌組織細(xì)胞高表達(dá)GR并介導(dǎo)骨骼肌肌膜ENaC表達(dá)增高，后者可能通過影響肌膜Na+內(nèi)流而使動作電位傳遞受阻，導(dǎo)致肌無力及肌萎縮，但其中效應(yīng)機(jī)制尚有待證實(shí)。

[1]時(shí)宏娟，焉傳祝，戴廷軍.類固醇肌病的研究現(xiàn)狀[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94(6)：476-478.

[2]李建萍,潘瑞福.類固醇肌病大鼠模型的建立及其骨骼肌病變的形態(tài)學(xué)研究[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2001，27(1):7-9.

[3]孫偉，湯球，江鵬亮，等.運(yùn)用系統(tǒng)論原理復(fù)制人類疾病動物模型[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2008，18(10):67-69.

[4]Kellenberger S,Schild L.Epithelial sodium channel/degenerin family of ion channels:a variety of functions for a shared structure[J].Physiol Rev,2002,82(3):735-767.

[5]Kellenberger S,Gautschi I,Schild L.An external site controls closing of the epithelial Na+channel ENaC[J].J Physiology,2002,543(Pt 2):413-424

[6]Staruschenko A,Adams E,Booth RE,et al.Epithelial Na+channel subunit stoichiometry[J].Biophys J,2005,88(6):3966-3975.

[7]Rich MM,Pinter MJ.Crucial role of sodium channel fast inactivation in muscle fibre inexcitability in a rat model of critical illness myopathy[J].J Physiol,2003,547(Pt 2):555-566.

[8]沈頡飛，王海業(yè)，麻穎宜，等.細(xì)胞內(nèi)滲透壓改變對三叉神經(jīng)電壓門控鈉離子通道電流的影響[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2012,30(4):338-342.

[9]Witkowski S,Lovering RM,Spangenburg EE.High-frequency electrically stimulated skeletal muscle contractions increase p70s6k phosphorylation independent of known IGF-I sensitive signaling pathways[J].FEBS letters,2010,584(13):2891-2895.

[10]Chen JW,Chen SY,Li HY,et al.Effect of exogenous interferon gamma on the healing of injured skeletal muscle following injury[J].China J Orthop Traumatol,2008,21(6):434-437.

[11]Reid MB.Response of the ubiquitin-proteasome pathway to changes in muscle activity[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005,288(6):1423-1431.

The study of the relationship between epithelial sodium channel expression and glucocorticoid-induced muscle atrophy*

LuXingyan1,ZhaiYuying1,ChenXin1,LiuYang1,LinXiaowen1,ChenJun1,YangGuozhu1,LuLi1,LiQingnan2,HuangRen2△

(1.SchoolofLifeScienceandBiopharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity/GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyCandidateDrugResearch,Guangzhou,Guangdong510006,China；2.GuangdongProvincialLaboratoryAnimalMonitoringInstitute/GuangdongProvincialKeyLaboratoryofLaboratoryAnimal,Guangzhou,Guangdong510633,China)

ObjectiveTo analyze the correlation between epithelial sodium channel (ENaC) protein expression and skeletal muscle atrophy on the base of steroids muscle atrophy (SMA) SD rat model,and to explore the possible effect of ENaC in the pathogenesis of SMA.MethodsThirty-two female SD rats aged 3 months were randomly divided into four groups:normal control group (C group,0.9% NaCl,4 times a week),treatment groups including low frequency group (L group),medium frequency group (M group) and high frequency group (H group).Dexamethasone (Dex) of 1 mg/kg was injected into the muscle,and the frequency of administration was,in order,2 times,4 times,6 times a week.After 4 weeks,the rats were executed.The gastrocnemius were got for being weighed,being paraffin-embedded,HE staining,and morphological observed.FCSA was tested.α-ENaC and glucocorticoid receptor (GR) immunohistochemical were analyzed.Results(1)The rat body weight and gastrocnemius wet weight decreased when compared to C group and between them there was a dose-dependent relationship.(2)Compared with C group,FCSA of treatment groups rats decreased,and between them there were dose dependent.(3)α-ENaC immunohistochemical analysis of gastrocnemius showed that,compared with C group,theIODvalues of L group,M group and H group rised.There was a dose-dependent relationship.GR immunohistochemical analysis showed that compared with C group,theIODvalues of M group and H group rised.TheIODvalue change of α-ENaC and GR were positively correlated.ConclusionIncreased expression of ENaC in skeletal muscle induced by GC,may be associated with steroid myopathy.

Dexamethasone;steroids muscular atrophy;receptors,glucocorticoid;α-epithelial sodium channel protein;immunohistochemistry

·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.003

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30971172)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B060300022)；廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2010-03)。作者簡介：陸幸妍(1963-)，本科，副教授，主要從事骨和骨骼肌代謝性疾病分子機(jī)制及藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的研究。△

，Tel：(020)84106801；E-mail:labking@sohu.com。

R337；R685

A

1671-8348(2016)24-3320-03

2016-02-22

2016-06-29)