參芍口服液對2型糖尿病心肌病大鼠心肌Toll樣受體4表達的影響*

代艷楠,張春來,周紅霞,韓鳳超,唐坤龍,張作鳳

(1.華北理工大學基礎醫學院/河北省慢性疾病重點實驗室/唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北唐山 063000；2.唐山工人醫院心內四科，河北唐山063000)

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參芍口服液對2型糖尿病心肌病大鼠心肌Toll樣受體4表達的影響*

代艷楠1,張春來2△,周紅霞1,韓鳳超1,唐坤龍1,張作鳳1

(1.華北理工大學基礎醫學院/河北省慢性疾病重點實驗室/唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北唐山 063000；2.唐山工人醫院心內四科，河北唐山063000)

目的通過觀察參芍口服液對2型糖尿病大鼠心肌組織Toll樣受體4(TLR4)和核因子-κB(NF-κB)表達的影響，探討其保護機制。方法將30只Wistar雄性大鼠隨機分為對照組、模型組和治療組，每組10只。模型組和治療組采用高脂飼料喂養加小劑量鏈脲佐菌素(25 mg/kg)腹腔注射的方法制作2型糖尿病心肌病大鼠模型，治療組給予250 mg·kg-1·d-1參芍口服液干預。采用左心室插管對大鼠心功能進行評估，免疫組織化學法和免疫印跡法檢測心肌組織的TLR4和NF-κB蛋白表達。結果心功能檢測中，模型組較對照組，左室舒張末期壓(LVEDP)明顯升高，左室收縮壓(LVSP)和左室壓力上升或下降最大速度(±dP/dtmax)降低(P<0.05)。治療組較模型組LVEDP降低，LVSP和±dP/dtmax升高(P<0.05)；免疫組織化學和免疫印跡顯示，模型組較對照組TLR4和NF-κB蛋白表達量明顯升高(P<0.05)，治療組較模型組TLR4和NF-κB蛋白表達量明顯降低 (P<0.05)。結論參芍口服液能有效改善2型糖尿病心肌病大鼠的心功能，其心肌保護作用可能與調控TLR4及其下游炎性因子水平有關。

參芍口服液；糖尿病并發癥；心肌疾病；炎癥；Toll樣受體4；大鼠,Wistar

近年，糖尿病心肌病發病率伴隨糖尿病患病率的上升而逐年上升[1]，是糖尿病患者高病死率的首要觸發因素[2]，已激起國內外學者研究的熱潮。至今其治療效果仍不理想，其中免疫系統與炎癥相互作用成為這一疾病發病機制的重要組成部分。近年來，發現Toll樣受體4(TLR4)作為跨膜信號轉導受體之一，是免疫反應和介導炎癥的重要模式識別受體，也是聯系二者的樞紐[3]。參芍口服液是精選丹參及赤芍等精制而成的中藥復方制劑，能提高機體的免疫功能，具有抗炎和免疫調節等藥理作用，但其對糖尿病心肌損傷的作用報道較少，本研究應用鏈脲佐菌素(STZ)制備實驗性糖尿病心肌病模型，觀察參芍口服液對糖尿病大鼠心功能的影響，并從調控TLR4受體改善炎癥損傷的角度探討參芍口服液對糖尿病大鼠心肌保護作用的可能機制。

1　材料與方法

1.1動物及試劑健康雄性Wistar大鼠30只，體質量(160±200)g，SPF級，由河北聯合大學實驗動物中心提供；參芍口服液(即寬心合劑，河北省唐山市工人醫院制劑室制備,批準文號：Z20050957，藥物組成：丹參250 g，黃芪250 g，赤芍藥150 g，當歸150 g，川芎75 g，桃仁125 g，紅花75 g，水蛭187.5 g，地龍250 g，清半夏125 g)。STZ(Sigma 公司，美國)；血糖儀、血糖試紙(強生公司，美國) ；免疫組化試劑盒(邁新生物技術有限公司，美國)；免疫印跡試劑盒(碧云天生物有限公司)；核因子-κB(NF-κB)單克隆抗體試劑盒(Abcam公司，美國)，TLR4多克隆抗體(北京博奧森公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型制作30只大鼠隨機分為對照組、模型組、治療組，每組10只。模型組和治療組采用高脂飼料喂養，對照組采用普通飼料，4周后模型組和治療組大鼠一次性腹腔注射STZ 25 mg/kg(pH=4.5)，對照組注射等劑量的生理鹽水，分別于第3、14天測大鼠空腹血糖(FBG)，模型組和治療組大鼠FBG為11.1～<30 mmol/L，并伴有多飲、多尿、多食現象確定為2型糖尿病模型。治療組給予參芍口服液(250 mg·kg-1·d-1)，對照組和模型組給予等量生理鹽水，灌胃8周。實驗末測各組大鼠FBG≥11.1 mmol/L且小于30 mmol/L，同時模型組和治療組經左心室插管檢測心功能指標，心功能改變較對照組大鼠有意義的最終確定為2型糖尿病心肌病大鼠模型，實驗末共27只大鼠(對照組10只，模型組8只，治療組9只)納入實驗，3只淘汰可能由于感染或酮癥酸中毒而致死。

1.2.2心功能檢測實驗末，對大鼠安裝呼吸機，將導管經頸總動脈送入左心室，穩定數分鐘后，測定左室收縮壓(LVSP)和舒張末壓(LVEDP)、左室壓力上升或下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.2.3蘇木精-伊紅(HE)染色10%中性甲醛固定充分后，經乙醇逐級脫水、透明、浸蠟、包埋后，切片(4 μm厚)，再經脫蠟、蘇木素7 min、伊紅8 min、透明、封片等步驟。光鏡觀察心肌細胞及細胞間質改變。

1.2.4免疫組織化學石蠟切片脫蠟后，枸櫞酸鈉抗原修復1 min，一抗為TLR4抗體(1∶150稀釋)和NF-κB抗體(1∶150稀釋)，加一抗后置于4 ℃冰箱過夜。用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，采用免疫組織化學圖像軟件分析結果。

1.2.5免疫印跡將標本進行 SDS-PAGE 電泳，將目的條帶電轉印法轉印至 PVDF 膜上，分別孵稀釋的抗體TLR4(1∶1 000)、抗體NF-κB(1∶1 000)過夜。結果采用生物凝膠圖像分析系統進行分析。

2　結　　果

2.1心功能檢測指標模型組較對照組LVEDP明顯升高，同時LVSP和±dp/dtmax下降(P<0.05)，治療組較模型組LVEDP降低，LVSP和±dp/dtmax升高(P<0.05)，見表1。

A：對照組；B：模型組；C：治療組。

圖1各組心肌組織的病理學改變(HE×400)

A：對照組NF-κB；B：模型組NF-κB；C：治療組NF-κB；D：對照組TLR4；E：模型組TLR4；F：治療組TLR4。

圖2　　各組大鼠心肌組織TLR4 和 NF-κB的表達(×400)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.2心肌形態學改變對照組肌纖維排列有序、致密，細胞結構清楚，細胞核橢圓或梭形，大小均一；模型組肌纖維排列紊亂，出現斷裂，心肌細胞水腫，細胞核大小不一，細胞間質變寬，滿視野見炎性細胞；治療組部分心肌纖維排列紊亂，見炎性細胞，見圖1。

2.3心肌組織TLR4和NF-κB免疫組織化學結果TLR4蛋白表達主要在心肌細胞膜上，NF-κB表達于心肌細胞質及細胞間質，陽性表達呈棕黃色顆粒沉著。模型組較對照組TLR4、NF-κB陽性表達明顯增多(P<0.05)，治療組較模型組明顯減少(P<0.05)，見圖2、表2。

表2　　各組大鼠心肌TLR4和NF-κB陽性細胞數

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.4心肌組織TLR4、NF-κB免疫印記結果與對照組比較，模型組大鼠心肌組織TLR4和NF-κB表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比，治療組大鼠心肌組織TLR4和NF-κB表達水平降低(P<0.05)，見圖3。

1：對照組；2：模型組；3：治療組；a：P<0.05，和與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

圖3各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB的表達

3　討　　論

糖尿病心肌病作為糖尿病特有的并發癥之一，是導致糖尿病晚期死亡的主要原因，因糖尿病代謝異常最終導致心肌代謝異常、心肌功能障礙和結構異常。如能早期找到有效而快速的診療方法,將對糖尿病心肌病產生積極影響。

本實驗通過高脂飲食結合小劑量STZ建立2型糖尿病心肌病模型，有研究表明，STZ對胰島B細胞具有高度選擇性，其誘導的糖尿病大鼠，符合人類糖尿病及其并發癥的病理變化過程及功能改變[4-5]。通過HE染色觀察到模型組大鼠心肌組織肌纖維排列紊亂，出現斷裂，細胞間質變寬，心肌細胞炎性水腫嚴重，提示本實驗建立的2型糖尿病大鼠模型出現心肌損傷，符合本次實驗動物模型的納入標準。

目前，天然免疫系統的激活和慢性炎癥為糖尿病并發癥的發病機制提供了新依據，TLR4是免疫反應和炎性反應聯系的樞紐。Shimamoto等[6]在研究缺血再灌注實驗中發現藥物阻斷TLR4或基因敲除TLR4，中性粒細胞、多種炎癥相關介質和過氧化脂質類的產生明顯減少。此外，Ogawa等[7]通過結扎小鼠左冠狀動脈建立急性大面積心肌梗死和慢性心力衰竭的模型，也發現模型組小鼠TLR4的表達明顯高于對照組。說明TLR4在炎癥介導的心臟疾病中起著重要作用。Ladefoged等[8]發現糖尿病小鼠胰島組織的TLR4的表達量是非糖尿病小鼠5倍多，且與血糖水平呈平行增長。本研究發現模型組大鼠心肌組織中TLR4、NF-κB的表達均明顯上調，且心肌細胞間質炎性細胞明顯增多，提示TLR4及其調控下的炎性因子可能參與擴張型心肌病(DCM)的發生、發展。

TLR4參與DCM發病的可能機制如下：TLR4作為一種跨膜糖蛋白，由胞外區、跨膜區、胞內區3部分組成，肌體在高糖條件下會產生大量脂多糖、熱休克蛋白60、游離脂肪酸等物質，TLR4胞外區能夠識別脂多糖及游離脂肪酸等[9]，并與之結合，進而激活TLR4。TLR4被激活后，通過髓樣細胞分化因子88(MyD88)依賴和MyD88非依賴兩種途徑，一方面調節胰島β細胞的基因(胰島素、PDXI等基因)表達，使胰島素分泌進一步受損[10]，另一方面下調NF-κB，誘導分化細胞因子和趨化因子[11]。參與免疫和炎性反應，使心肌受損，心室重構，出現心肌收縮和舒張功能障礙。

因此，將TLR4作為炎癥和免疫性疾病的治療靶點，以“活血化瘀、益氣通絡”為法而立方參芍口服液。參芍口服液主要成分為丹參素，有研究表明丹參素具有心腦血管保護、抗動脈硬化及抗炎作用[12]。薛中文等[13]通過建立冠狀動脈粥樣硬化的大鼠模型，發現參芍口服液可降低組織炎性因子表達，改善冠狀動脈粥樣硬化的病變程度。本實驗治療組采用參芍口服液進行干預后，心肌組織TLR4、NF-κB炎性因子的表達較模型組降低；心肌間質炎性細胞減少，心功能得到改善，其機制可能是參芍口服液參與調節TLR4控制的炎癥通路從而改善DCM心功能不全的癥狀，對糖尿病心肌病起到保護作用。

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Effects of Shenshao oral liquid on expressions of Toll-like receptor-4 in myocardium of rats with type 2 diabetic cardiomyopathy*

DaiYannan1,ZhangChunlai2△,ZhouHongxia1,HanFengchao1,TangKunlong1，ZhangZuofeng1

(1.SchoolofBasicMedicalSciences，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology/HebeiProvincialKeyLaboratoryforChronicDiseases/TangshanKeyLaboratoryforPreclinicalandBasicResearchonChronicDiseases,Tangshan,Hebei063000,China;2.FourthDepartmentofCardiology,TangshanWorker′sHospital,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo observe Shenshao oral liquid on the expression of TLR4 and NF-κB in myocardial tissue of type 2 diabetic rats,and to explore its protective effects.MethodsThirty male Wistar rats were randomly divided into control group,model group,treatment group(n=10).High fat diet and low dose of streptozotocin(25 mg/kg) were utilized to establish a rat model of type 2 diabetic cardiomyopathy(DCM).The rats in treatment group were fed with Shenshao oral liquid of 250 mg·kg-1·d-1.Ventricular cannulation was used to assess the cardiac functions.The expression levels of TLR4 and NF-κB in the cardiac tissues were determined by Western blotting and immunohistochemistry.ResultsCompared with control group,left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) significantly increased,left ventricular systolic pressure (LVSP) and the maximum speed of left ventricular pressure rise or fall(±dp/dtmax) were lower in the model group (P<0.05).Compared with the model group,LVEDP reduced,LVSP and ± dP/dtmax increased in the treatment group(P<0.05).Compared with the control group,the expression levels of TLR4 and NF-κB in the cardiac tissues significantly increased in the model group (P<0.05),which was decreased in treatment group as compared with model group (P<0.05).ConclusionShenshao oral liquid can effectively attenuate the cardiac functions of rats with type 2 DCM by the regulation of levels of TLR4 and its downstream inflammatory cytokines.

Shenshao oral liquid;diabetic complications;cardiomyopathies;inflammation;Toll-like receptor 4;rats,Wistar

論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.005

2013年河北省社會科學基金項目(HB13LJ003)；唐山科技支撐計劃項目(12150222b-15)。作者簡介：代艷楠(1988-)，碩士，主要從事心血管疾病的研究。△

,Tel：15930458965 ；Email：120zcl@sina.com。

R542.2

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1671-8348(2016)24-3327-03

2016-02-07

2016-06-25)