康萊特注射液聯合紫杉醇對人乳腺癌細胞的化療增效作用*

唐翠萍，吳　陽，周寒靜，張　濤△

(重慶醫科大學附屬第一醫院：1.腫瘤科；2.心血管內科　400016)

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康萊特注射液聯合紫杉醇對人乳腺癌細胞的化療增效作用*

唐翠萍1，吳陽2，周寒靜1，張濤1△

(重慶醫科大學附屬第一醫院：1.腫瘤科；2.心血管內科400016)

目的探討康萊特注射液(KLT)對紫杉醇(PTX)抑制人乳腺癌細胞增殖及侵襲能力的增效作用及其相關機制。方法本實驗以體外培養的人乳腺癌細胞為研究對象，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法、Transwell法檢測MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖、侵襲能力，實時熒光定量(qRT)-PCR、Western blot 分別檢測C-myc、CyclinD1和血管內皮生長因子(VEGF) mRNA和蛋白水平變化。結果PTX單藥能有效抑制人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲能力，降低C-myc、CyclinD1 和VEGF mRNA及蛋白的表達，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；KLT呈濃度依賴地增強PTX的作用，與PTX單獨用藥比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論KLT具有增強PTX抗乳腺癌細胞增殖、侵襲能力的作用，此作用可能與下調C-myc、CyclinD1和VEGF的表達相關。

康萊特注射液；紫杉醇；乳腺腫瘤；細胞增殖；腫瘤侵潤

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤，已成為女性癌癥相關死亡的重要原因[1-2]。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是乳腺癌術后常用的輔助化療藥物，但因毒副作用大，使得部分患者難以耐受，同時有部分患者對其耐藥，使其療效局限，遠期生存率未見明顯提高。康萊特注射液(Kanglaite injection,KLT)是從傳統中藥薏苡仁中提取的抗腫瘤細胞活性物質，其注射液主要成分為注射用薏苡仁油，該藥同化療藥物聯合應用可提高一些腫瘤對化療藥物的敏感性，減少化療過程中的毒副反應，其聯合用藥在肺癌的治療中已取得顯著進展[3-4]，但在乳腺癌治療中的應用，目前國內外尚未見大量報道。本實驗擬采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法、Transwell小室侵襲等方法，研究KLT聯合PTX對人乳腺癌細胞的化療增效作用，并探討KLT能否增強PTX對人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖及侵襲能力的抑制作用，為進一步尋找增強乳腺癌化療效果的治療方案提供基礎實驗材料。

1　材料與方法

1.1主要材料及儀器人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞株(中科院上海細胞生物研究所)。紫杉醇注射液(四川太極制藥)，康萊特注射液(浙江康萊特藥業)，TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG(中杉金橋公司)，胰酶及DMEM培養基(Gibco公司，美國)，逆轉錄試劑盒(Fermentas公司，中國)，紫外分光光度計(GE公司，美國)，電化學發光(ECL)儀(Viagene公司，美國)，PCR擴增儀(深圳黑馬公司)，酶標儀(Thermo公司，美國)，Transwell小室(Millipore公司，美國)，倒置顯微鏡及正置顯微鏡(尼康公司，日本)。

1.2方法

1.2.1細胞培養人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞接種于培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基5 mL，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度孵箱中傳代培養，每2～3天傳代1次。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖能力以人乳腺癌MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞為研究對象，各設置A、B、C、D、E、F、G 7組，其中A組為對照組，加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)，B組為KLT(20 μg/mL)單藥組，C組為PTX(10 μg/mL)單藥組，D、E、F、G 各組在PTX(10 μg/mL)的基礎上，分別加入濃度為5、10、20、40 μL/mL的KLT，H組為KLT(10 μg/mL)，取處于對數生長期的細胞，調整密度為6×103個/孔，接種于96孔板，每孔200 μL，每組設5個復孔，另設5個空白對照孔(即調零孔，只加培養基而不加細胞)，待細胞貼壁后，吸去培養基，每孔加入含有各藥物的培養基200 μL，繼續培養48 h。吸棄培養基，PBS清洗2次，加入含20 μL MTT培養液200 μL培養4 h，棄上清液，加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)溶解液，水平搖床震蕩10 min后用酶標儀測定570 nm處吸光度值(A)值，以空白對照孔調零，計算生長抑制率(IR)，IR=[(1-實驗組A570)/對照組A570]×100%。實驗重復3次。

表1　　引物序列

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

1.2.3Transwell檢測細胞侵襲能力實驗分組同1.2.2，各組細胞換用無血清DMEM培養基饑餓培養12 h，調整細胞濃度每毫升為2× 105個，每個侵襲小室預包被基質膠，上室加入200 μL無血清細胞懸液(24孔板)，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基500 μL，培養48 h后，棄培養基，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，經PBS漂洗后，取出小室，酶標儀上測A570值，間接反映細胞數量，并計算各組IR。實驗重復3次。IR=[(1-實驗組A570)/對照組A570]×100%。

1.2.4實時熒光定量(qRT)-PCR檢測細胞C-myc、CyclinD1、血管內皮生長因子(VEGF) mRNA表達實驗分4組，即對照組：加入等量PBS；KLT單藥組：根據1.2.2及1.2.3實驗結果，選取KLT 10 μL/mL；PTX單獨給藥組：加入PTX 10 μg/mL；聯合用藥組：10 μg/mL PTX+10 μL/mL KLT。取處于對數生長期細胞，調整細胞濃度為 3× 105個/孔并接種于96孔板中，每孔加入培養基2 mL，過夜培養，根據實驗分組給藥。待細胞生長達90%左右時，Trizol法抽提細胞總RNA，qRT-PCR法測定C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA水平。引物序列見表1。PCR反應在BIO-RAD儀器內進行。

1.2.5Western blot檢測細胞C-myc、CyclinD1、VEGF蛋白表達實驗分組同1.2.4，經分組給藥后培養48 h，常規提取總蛋白。二喹啉甲酸法(BCA法)測定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃金屬浴加熱5 min，每孔加入40 μg蛋白，10% SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，將電泳產物轉移至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h，加C-myc、CyclinD1、VEGF一抗(1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗置室溫下孵育2 h。ECL顯影。

2　結　　果

2.1對乳腺癌細胞增殖的影響MTT法結果顯示，在MCF-7細胞，D、E、F、G各組抑制率分別增加29.83%、63.86%、67.11%及72.39%；在MDA-MB-231細胞，其抑制率分別增加27.52%、51.82%、62.89%、69.85%。結果表明，KLT呈濃度依賴性的增強PTX對乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用。MCF-7和MDA-MB-231藥物作用48 h后抑制率見圖1。

2.2對乳腺癌細胞侵襲能力的影響與對照組相比，各處理組MCF-7、MDA-MB-231細胞的侵襲能力均明顯抑制，其A值均明顯降低(P<0.05)。在MCF-7細胞，聯合用藥組抑制率分別增加90.76%、176.29%、229.74%及256.82%；在MDA-MB-231細胞，其抑制率分別增加100.64%、203.32%、242.82%及274.39%。各組A570值抑制率見表2。康萊特能增強PTX對MCF-7、MDA-MB-231細胞侵襲能力的抑制作用，且增強效應與KLT濃度密切相關。根據2.1及2.2實驗結果，D、E、F、G組間差異無統計學意義(P>0.05)，故選取E組進行后續研究。

*:P<0.05，與C組比較。

圖1　　各組乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞的抑制率比較

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與C組比較；-：無數據。

2.3對乳腺癌細胞C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA表達的影響qRT-PCR結果(圖2)顯示：C組，C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA的表達在MCF-7細胞分別下調了85.32%，54.29%及92.68%，在MDA-MA-231細胞，分別下調了66.36%、62.04%及56.31%；E組，各組mRNA表達分別下調了47.30%、54.41%、41.38%、34.15%、38.46%、41.10%。KLT和PTX均能抑制乳腺癌細胞C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA的表達，且KLT明顯增強PTX的此作用。

a：P<0.05，與A組相比；b：P<0.05，與C組相比。

圖2各組對乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞中C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA表達的影響

A、C：乳腺癌MCF-7細胞，各蛋白水平變化；B、D：MDA-MB-231細胞，各蛋白水平變化；a：P<0.05，與A組相比；b：P<0.05，與C組相比。

圖3各組對乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞中C-myc、CyclinD1、VEGF 蛋白水平表達的影響

2.4對乳腺癌細胞C-myc、CyclinD1、VEGF蛋白表達的影響Western blot結果(圖3)顯示：PTX能明顯抑制乳腺癌細胞C-myc、CyclinD1、VEGF 蛋白的表達，在MCF-7(圖3A、C)及MDA-MA-231(圖3B、D)細胞中，各蛋白的表達均下調；E組與C組相比：各蛋白表達均明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)。

3　討　　論

Wnt/β-catenin相關信號通路在胚胎發育、代謝及干細胞的維持中發揮著重要的生物學作用，在多種腫瘤細胞中異常激活，包括乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌等。研究發現，C-myc、CyclinD1、VEGF為Wnt/β-catenin信號通路發揮其調控細胞活力、增殖、遷移、侵襲、血管形成及形態發生的關鍵下游因子[5-7]，其過表達與Wnt/β-catenint信號通路異常激活有關。C-myc及CyclinD1作為原癌基因，參與了細胞的增殖、分化、凋亡、調控細胞周期，并與多種腫瘤的發生、發展有關；而VEGF是一種高特異性的血管內皮分裂素，具有促進血管內皮細胞的增殖、侵襲、遷移、分化及誘導血管發生的作用，其與惡性腫瘤的浸潤轉移有重要關聯。因此，C-myc、CyclinD1及VEGF可能是抗腫瘤細胞增殖、侵襲能力的重要靶點[8-9]。PTX為紅豆杉屬植物中結構復雜的一種次生代謝產物，目前廣泛應用于乳腺癌的輔助治療和挽救治療[10]，其抗腫瘤作用除與其作用于細胞周期有關外，還與細胞信號的轉導通路，如抑制核因子-κB(NF-κB)/κB-a 及Wnt/β-catenin信號通路有關[11-12]。本實驗以體外培養的人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞為研究對象，采用MTT、Transwell法觀察PTX對其增殖、侵襲的影響，結果顯示PTX能顯著抑制MCF-7及MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲能力。qRT-PCR和Western blot 結果顯示，PTX能明顯降低乳腺癌細胞中C-myc、CyclinD1、VEGF的表達，提示PTX抗乳腺癌細胞增殖、侵襲的能力可能與作用于Wnt/β-catenin相關信號通路有關。但隨著用藥時間的延長，PTX耐藥現象越來越嚴重[13]，為此，尋求新的聯合用藥方案，提高乳腺癌療效，越來越受到重視。KLT是中藥薏苡仁中提取的活性成分，具有抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡、促進機體產生多種細胞因子和提高機體免疫能力等作用[14]，能較強地抑制和殺傷多種腫瘤細胞，除作用于細胞周期外，還可活化一些促凋亡因子，促進細胞凋亡。其作為一種高效的輔助藥能增強多種化療藥的抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管形成，調控腫瘤耐藥基因和信號通路[15]。本實驗從細胞水平研究了KLT對PTX抗乳腺癌細胞侵襲、遷移能力的增效作用。結果顯示，不同濃度的KLT聯合PTX作用48 h后，細胞增殖侵襲能力與PTX單獨給藥組相比抑制率明顯增加，在KLT濃度小于10 μL/mL時，其抑制效果與KLT濃度呈正相關，KLT濃度大于10 μL/mL時，其抑制效率未見明顯增加。qRT-PCR和Western blot結果顯示，KLT能明顯增強PTX對乳腺癌細胞Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA和蛋白水平的下調作用。

目前乳腺癌治療仍采用以外科手術為主的包括化療、放療、分子靶向治療及內分泌治療的綜合治療模式，但效果不甚理想。包括KLT在內的多種中藥被證實具有增強腫瘤對化療藥物敏感性的功能，從而使化療藥更有效地殺傷腫瘤細胞。本實驗結果表明，KLT與化療藥物PTX聯合應用可明顯增強PTX抗乳腺癌細胞增殖、侵襲的能力，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路中C-myc、CyclinD1、VEGF的表達相關。但本研究僅檢測了用藥前后C-myc、CyclinD1、VEGF的表達，對其信號通路的深入研究可通過阻斷劑進一步阻滯Wnt/β-catenin信號通路來觀察KLT聯合PTX對乳腺癌細胞增殖、侵襲及C-myc、CyclinD1、VEGF表達的變化情況。

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The chemosensitization effect of Kanglaite injection combined with Paclitaxel in human breast cancer cells*

TangCuiping1,WuYang2,ZhouHanjing1,ZhangTao1△

(1.DepartmentofOncology;2.DepartmentofCardiovascular,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo explore the anti-proliferation and anti-invasion effects of Kanglaite injection(KLT) in combination with Paclitaxel(PTX) on human breast cancer cell and to investigate the mechanism of the chemosensitization effect.MethodsMTT and Transwell assays were used to detect the inhibitory rate of proliferation and invasion of MCF-7 and MDA-MB-231 cells,qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of C-myc,CyclinD1,VEGF mRNA and their protein levels.ResultsThe study showed that treatment with PTX alone could significantly inhibit the proliferation and invasion of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines,lower the expression of C-myc,CyclinD1 and VEGF in both mRNA and protein levels,compared with the control group (P<0.05);KLT dramatically strengthened the effect of PTX in a concentration-dependent manner,compared with PTX alone (P<0.05).ConclusionThe result shows that KLT could enhance the anti-proliferation and anit-invasion effects of PTX on human breast cancer cells,which could have relationship with down-regulating the expression of C-myc,CyclinD1 and VEGF.

Kanglaite injection;Paclitaxel;breast neoplasms;cell proliferation;neoplasm invasivenss

論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.008

國家臨床重點專科建設項目[國衛辦醫函(2013)544號]；重慶市自然科學基金資助項目(cstc2012jjA10138)。作者簡介：唐翠萍(1991-)，在讀碩士，主要從事腫瘤綜合治療方面的研究。△

,Tel:13708311156；E-mail:tumorzzt@163.com。

R730.53

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1671-8348(2016)24-3336-04

2016-02-18

2016-06-27)