白花蛇舌草粗黃酮對小鼠肝損傷保護作用的研究*

鄭　岳，徐梅梅，孫　偉，盧坤玲，鄭繼堯，王益民△，李　健

(1.秦皇島市第一醫(yī)院消化科，河北秦皇島 066000；2.燕山大學環(huán)境與化學工程學院生物技術(shù)與工程系，河北秦皇島 066004)

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白花蛇舌草粗黃酮對小鼠肝損傷保護作用的研究*

鄭岳1，徐梅梅1，孫偉1，盧坤玲1，鄭繼堯1，王益民1△，李健2

(1.秦皇島市第一醫(yī)院消化科，河北秦皇島 066000；2.燕山大學環(huán)境與化學工程學院生物技術(shù)與工程系，河北秦皇島 066004)

目的探討白花蛇舌草黃酮對小鼠肝損傷的保護作用及機制。方法昆明種雄性小鼠40只隨機分為空白對照組、陰性對照組、陽性對照組、白花蛇舌草粗黃酮低劑量組和高劑量組，灌胃給藥14 d?？瞻讓φ战M腹腔注射豆油溶液，陰性對照組、低高劑量白花蛇舌草粗黃酮處理組及陽性對照組使用 2%四氯化碳(CCl4)豆油溶液給予腹腔注射誘導小鼠急性肝損傷模型，24 h 后眼球取血分離血清，測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氮酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)活性；處死小鼠制備肝勻漿,測定肝勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平，同時取肝臟組織進行病理學檢查。結(jié)果高低劑量白花蛇舌草粗黃酮均可顯著降低血清ALT、AST、ALP和GGT水平，顯著升高肝臟組織SOD、CAT和GSH活性，降低肝組織MDA水平，白花蛇舌草粗黃酮對肝臟組織結(jié)構(gòu)也顯示顯著保護作用。結(jié)論白花蛇舌草粗黃酮對CCl4誘導急性肝損傷有顯著保護作用，可能是通過增加肝組織抗氧化能力而實現(xiàn)的。

肝損傷保護；白花蛇舌草；粗黃酮；抗氧化；疾病模型，動物

一些化學毒物和藥物常常導致急性肝細胞損傷，臨床上可見肝功能異常，嚴重時可發(fā)生肝功能衰竭。四氯化碳(CCl4)模型是肝損傷的經(jīng)典模型，能準確反映肝細胞的功能、代謝及形態(tài)學變化，重復(fù)性好[1-2]。黃酮類化合物廣泛存在于多種植物中，具有多種藥理活性和較低的毒性[3]。其對多種原因造成的肝損傷均有不同程度的保護作用，是近年來肝損傷治療研究的熱點?，F(xiàn)代藥理研究證明，白花蛇舌草黃酮類化合物具有調(diào)節(jié)免疫、抗化學誘變、抗腫瘤、抗菌抗炎、抗氧化等作用[4]。而關(guān)于其對化學性肝損傷的研究，目前缺少系統(tǒng)性研究。本研究以CCl4誘導肝損傷小鼠為模型，探討白花蛇舌草粗黃酮對小鼠急性肝損傷的保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料實驗動物雌性昆明種小鼠(6周齡，18～22 g)40只購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。主要試劑白花蛇舌草購于秦皇島市唐人藥店(產(chǎn)地：河北安國)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氮酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測試劑盒購于南京建成試劑公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購于北京中杉金橋公司；所有其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1白花蛇舌草黃酮的提取取干燥的白花蛇舌草30 g，加入600 mL 70%的無水乙醇，80 ℃水浴條件下回流提取2 h，重復(fù)提取2次，獲得白花蛇舌草醇提物。將醇提物溶解于水中，加入1/3體積的石油醚，震蕩靜置分層，棄去石油醚溶解物，萃取4次除脂溶性雜質(zhì)，得水相加1/3體積的乙酸乙酯萃取4次，收集乙酸乙酯相后減壓回收得白花蛇舌草粗黃酮浸膏[5]。

1.2.2實驗小鼠的分組將要處理的40只小鼠隨機分為5組，分別為空白對照組、陰性對照組、陽性對照組(雙環(huán)醇，150 mg/kg)、低劑量組(白花蛇舌草粗黃酮50 mg/kg)、高劑量組(白花蛇舌草醇提物100 mg/kg)，每組8只。連續(xù)灌胃給藥14 d，空白組和陰性對照組灌胃給予等體積的生理鹽水，劑量為每只 0.3 mL。第14天灌胃給藥1 h后，空白組使用豆油溶液給予腹腔注射，陰性對照組、高低劑量組及陽性對照組使用2% CCl4豆油溶液給予腹腔注射，注射體積均為 0.2 mL。禁食12 h后，高、低劑量組灌胃給予相應(yīng)劑量的粗黃酮，陽性對照組灌胃給予雙環(huán)醇，陰性對照組和空白組灌胃給予等量的生理鹽水。30 min后，摘除眼球取血，取肝臟進行指標檢測[6]。

1.2.3小鼠血清肝功能生化指標的測定處死小鼠前摘眼球取血，離心獲血清，用AST、ALT、ALP、GGT檢測試劑盒進行檢測。

1.2.4小鼠肝組織勻漿抗氧化指標測定摘取肝臟，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩遍，準確稱取組織質(zhì)量，加入9倍體積的生理鹽水研磨成組織勻漿(g∶mL=1∶9)，離心取上清液，制備成10%的組織勻漿。用MDA、SOD、CAT、GSH-PX檢測試劑盒進行檢測。

1.2.5肝組織形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)觀察解剖觀察肝臟形態(tài)、顏色，留取相同部位約5 mm ×5 mm ×3 mm肝組織，通過中性緩沖甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片后作常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)、肝細胞壞死等病理變化。

2　結(jié)　　果

2.1肝臟形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)觀察解剖肝臟組織發(fā)現(xiàn)，空白對照組小鼠肝臟表面光滑，輪廓清晰；陰性對照組小鼠肝臟組織較粗糙，顏色較暗；而高劑量組表面較光滑，色澤較鮮亮。光鏡下可見空白對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，基本無炎性細胞浸潤，肝細胞形態(tài)正常(圖1A)。陽性對照組肝細胞腫脹，胞漿疏松化，核深染，可見明顯的點狀和灶狀壞死(圖1B)。高劑量組肝臟組織損傷明顯減少，偶爾可見到單個壞死肝細胞，炎性細胞浸潤明顯減少(圖1C)。

2.2各組小鼠血清ALT、AST、ALP和GGT水平比較與空白對照組相比，陰性對照組血清ALT水平增高(P<0.05)，AST、ALP和GGT水平均明顯升高(P<0.01)；與陰性對照組相比較，高、低劑量組和陽性對照組類似，血清ALT、AST、ALP和GGT水平均明顯降低(P<0.01)，見表1。

A：空白對照組；B：陰性對照組； C：高劑量組。

圖1　　各組小鼠肝組織病理切片觀察(×200 )

a:P<0.05，b:P<0.01，與空白組比較;c:P<0.05，d:P<0.01,與陰性對照組比較。

表2　　各組小鼠SOD、MDA 、CAT、GSH水平比較

續(xù)表2　　各組小鼠SOD、MDA 、CAT、GSH水平比較

a:P<0.05，b:P<0.01，與空白組比較;c:P<0.05，d:P<0.01,與陰性對照組比較。

2.3各組小鼠肝臟組織MDA、CAT水平和SOD、GST活性比較與空白對照組相比，陰性對照組小鼠血清中MDA水平升高(P<0.01)。與陰性對照組小鼠相比，低劑量組可明顯升高肝臟SOD、CAT、GSH活性(P<0.01)，高劑量組可升高肝臟SOD、GSH活性(P<0.05)，明顯升高CAT活性(P<0.01)，見表2。

3　討　　論

CCl4引起肝損傷是傳統(tǒng)的肝毒模型，CCl4對肝損傷的毒性作用是通過脂質(zhì)過氧化作用進行的[1-2]。CCl4在肝微粒體細胞色素P450酶激活下產(chǎn)生活性自由基CCl3，這些自由基可與肝細胞內(nèi)大分子發(fā)生共價結(jié)合，可攻擊肝細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，損傷肝細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使膜通透性升高，導細胞腫脹壞死[7-8]。

肝細胞變性壞死，可使肝細胞內(nèi) ALT、AST 大量釋放，導致血清中 ALT、AST 水平升高[9]。阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎都會使ALP升高。GGT在急性肝炎、慢性活動性肝炎及肝硬化失代償時輕中度升高。本實驗中 CCl4造模末次采血測定，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中 ALT、AST、ALP和GGT 活性升高，證明 CCl4致小鼠肝損傷造模成功。其他學者用此法造模出現(xiàn)了相似結(jié)果[10-11]。CCl4誘導肝損傷小鼠通過高、低劑量白花蛇舌草粗黃酮干預(yù)，血清中肝酶水平顯著降低，說明白花蛇舌粗黃酮能顯著降低 CCl4引起的急性肝損傷。實驗小鼠肝臟解剖觀察結(jié)果和病理切片大致正常，也證明其具有保肝活性。

通過肝勻漿 SOD、MDA、CAT 和 GSH 聯(lián)合檢測可以反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[12]。通過 CCl4對小鼠造模顯示，陰性對照組小鼠肝組織 SOD、GSH、CAT 活性明顯下降，MDA 水平明顯增加，提示肝組織中氧化應(yīng)激明顯，說明 CCl4造成的肝損傷與氧化應(yīng)激有明顯的關(guān)系。高、低劑量白花蛇舌草粗黃酮處理組，可顯著降低肝組織中 MDA水平，上調(diào)SOD、GSH-Px和 CAT活性，說明白花蛇舌草粗黃酮對CCl4誘導肝損傷的保護作用可能是通過增加小鼠肝臟組織抗氧化能力來實現(xiàn)的。

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Study on crude flavonoids from Oldenlandiadiffusa on protection against liver injury in rats*

ZhengYue1，XuMeimei1，SunWei1，LuKunLing1，ZhengJiyao1，WangYimin1△，LiJian2

(1.DepartmentofGastroenterology，theFirstHospitalofQinhuangdaoCity，Qinhuangdao，Hebei066000，China；2.DepartmentofBiologicalEngineering，CollegeofEnviromentandChemicalEngineering,YanshanUniversity，Qinhuangdao，Hebei066004，China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of crude flavonoids from Oldenlandiadiffusa(CFOD) on acute liver injury induced by carbon tetrachloride (CCl4).MethodsForty Kunming mice were divided into blank control group,negative control group,positive control group,CFOD low dose treatment group and CFOD high dose treatment group.The experiment mice were treated by intragastric administration for 14 days.And the mice in blank control group were treated with soya-bean oil by intraperitoneal injection,and the other groups were got the 2% CCl4soya-bean solution by intraperitoneal injection to induce the liver injury of the mice.After 24 hours,the serum was collected and the ALT,AST,ALP and GGT activities were measured.After the mice were sacrificed,the homogenate of liver was prepared to determine the levels of SOD,MDA,CAT and GST.ResultsBoth of the high and low doses of CFOD could reduce the levels of ALT,AST,ALP and GGT in serum significantly,and the activities of SOD,CAT and GST in liver homogenate were up-regulated by the treatments of low and high CFOD.Furthermore,both of the treatments of low and high CFOD could decrease the MDA level in liver homogenate and showed significant protective effect on the microstructure of the mice liver.ConclusionCFOD has a significant protective effect on the acute liver injury induced by CCl4,which could promote the liver antioxidant activity.

liver injury protection;Oldenlandiadiffusa;crude flavonoids;antioxidant;disease models,animal

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.009

河北省國際合作項目(14397702D)。作者簡介：鄭岳(1965-)，碩士，主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)疾病肝損傷和消化道腫瘤的研究?！?/p>

，Tel：18603359028；Email：gdsd0513@126.com。

R575.2+9

A

1671-8348(2016)24-3340-03

2016-02-15

2016-06-30)