miR-21對人喉鱗癌Hep2細胞增殖與凋亡的影響

曲　莉

(南陽市中心醫院耳鼻喉二病區，河南南陽 473000)

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miR-21對人喉鱗癌Hep2細胞增殖與凋亡的影響

曲莉

(南陽市中心醫院耳鼻喉二病區，河南南陽 473000)

目的探討miR-21對人喉鱗癌Hep2細胞增殖與凋亡的影響。方法脂質體LipofectamineTM2000將miR-21 inhibitor和miR-21陰性對照(NC)轉入Hela細胞，四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活力，克隆實驗及Hoechst染色分別檢測細胞增殖與凋亡情況，Western blot檢測人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)、程序化死亡蛋白4基因(PDCD4)、Bax、Bcl-2表達及蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平。結果與miR-21 NC比較，miR-21 inhibitor能顯著抑制細胞活力[(0.728±0.045)vs.(0.393±0.018),P<0.01]，降低細胞克隆數目[(158.38±14.47)vs.(65.52±6.86),P<0.01]，提高細胞凋亡率[(8.45±0.67)%vs.(40.23±3.46)%,P<0.01]，并上調PTEN、PDCD4、Bax表達，下調Bcl-2表達及降低AKT磷酸化水平(P<0.01)。結論miR-21 inhibitor通過PTEN/AKT信號通路抑制人喉鱗癌Hep2細胞增殖和誘導凋亡，并調節細胞凋亡相關蛋白的表達。

miR-21；人喉鱗癌Hep2細胞；細胞增殖；細胞凋亡

喉鱗癌是我國耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤，占耳鼻咽喉科腫瘤的36%左右，其中喉鱗狀細胞癌是其主要病理類型，占90%以上，手術治療、化學療法和放射治療是其主要治療方式，但對中晚期患者預后及5年生存率效果欠佳[1]。而喉鱗癌發病機制尚未清楚，吸煙、飲酒、病毒感染、環境污染、癌基因的激活及抑癌基因的失活都可能是其病因。miRNA是目前新發現的一類癌基因或抑癌基因，并與腫瘤的發生、發展密切相關，在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲等生物學行為中起重要作用[2]。已通過miRNA芯片技術證實48對喉鱗狀細胞癌標本中4個miRNA表達量顯著上調，包括miR-21[3]。也發現喉鱗狀細胞癌患者血清中miR-21表達量顯著增高，并與淋巴結轉移密切相關，并能作為喉鱗狀細胞癌標記物及預后的獨立因子[4]。提示miR-21在喉鱗癌中過表達，并作為癌基因參與喉鱗癌的發生、發展。本研究擬通過下調人喉鱗癌細胞中Hep2中miR-21的表達，探討其對Hep2細胞增殖及凋亡的影響，從而為喉鱗癌的診斷及預后判斷提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株人喉鱗癌細胞Hep2購于中國科學院細胞庫，目錄號：TCHu21。

1.1.2主要試劑和儀器兔抗Bax，Bcl-2單克隆抗體(Epitmics公司，美國)；兔抗PDCD4、PTEN、AKT、p-AKT單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)；miR-21 inhibitor及對照miR-21 NC(上海吉瑪制藥技術有限公司)；Hoechst 33258染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)法(Gibco公司，美國)；胎牛血清、DMEM培養基(Hyclone公司，美國)。迷你雙垂直電泳儀、迷你轉印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(Bio-Rad公司，美國)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測Hela細胞活力將人喉鱗癌細胞Hep2接種于96孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-21 inhibitor和miR-21陰性對照(negative control,NC)。48 h后，加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續培養4 h后吸棄培養液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL，震蕩使結晶物充分溶解，于酶標儀560 nm處測OD值，以OD值表示細胞相對活力。

1.2.2集落形成實驗將人喉鱗癌細胞Hep2接種于96孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-21 inhibitor和miR-21 NC，48 h后，用含10%甲醛和0.1%結晶紫染液固定染色。輕輕甩去染色液，拍照分析。

1.2.3Hoechst染色將人喉鱗癌細胞Hep2接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-21 inhibitor和miR-21 NC。48 h后消化收集細胞，后按照Hoechst 33258染色試劑盒說明書進行操作，4%多聚甲醛固定，Hoechst 33258染色液避光染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4Western blot將人喉鱗癌細胞Hep2接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-21 inhibitor和miR-21 NC。48 h后消化收集細胞，加入RIPA裂解液裂解，離心即可獲得總蛋白。根據BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉膜。一抗溶液孵育，4 ℃過夜；二抗溶液中室溫孵育。在凝膠成像系統中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

2　結　　果

2.1miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細胞Hep2活力的影響人喉鱗癌細胞Hep2細胞轉染miR-21 inhibitor和miR-21 NC 48 h后，經MTT實驗發現miR-21 inhibitor能顯著抑制細胞活力[(0.728±0.045)vs.(0.393±0.018)]，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細胞Hep2克隆形成及凋亡的影響miR-21 inhibitor能顯著減少Hep2細胞克隆數目[(158.38±14.47)vs.(65.52±6.86)]，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。miR-21 inhibitor亦能顯著提高Hep2細胞凋亡率[(8.45±0.67)%vs.(40.23±3.46)%]，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

A：miR-21 NC；B：miR-21 inhibitor。

圖1miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細胞Hep2克隆形成能力的影響

A：miR-21 NC；B：miR-21 inhibitor。

圖2miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細胞Hep2凋亡的影響

2.3miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細胞Hep2中PDCD4、Bax及Bcl-2表達量的影響miR-21 inhibitor能顯著上調PDCD4及Bax表達(P<0.01)，下調Bcl-2表達(P<0.01)，見圖3、表1。

2.4miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細胞Hep2中PTEN/AKT信號通路的影響miR-21 inhibitor能顯著上調PTEN表達(P<0.01)，降低AKT磷酸化水平(P<0.01)，見圖4、表2。

圖3　　　　　miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細胞Hep2中PDCD4、Bax及Bcl-2表達量的影響

項目Bcl-2BaxPDCD4miR-21NC1.143±0.0840.345±0.0731.296±0.089miR-21inhibitor0.367±0.027*1.012±0.025*0.379±0.063*

*：P<0.01，與miR-21 NC比較。

圖4　　　　　miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細胞Hep2中PTEN/AKT信號通路的影響

項目PTENp-AKT/AKTmiR-21NC0.354±0.0260.612±0.062miR-21inhibitor1.043±0.079*0.342±0.035*

*：P<0.01，與miR-21 NC比較。

3　討　　論

miR-21是2001年Lagos-Quintana等在非脊椎動物和脊椎動物中首次發現的，隨后在小鼠的神經元細胞及Hela細胞中陸續檢測到，已證實miR-21與喉癌、大腸癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤的發生、發展密切相關，其表達呈上調趨勢[2,5]。Cao等[3]通過miRNA芯片分析也證實48例喉鱗狀細胞癌標本中4個miRNA表達量顯著上調，包括miR-21。Wang等[4]檢測52例喉鱗狀細胞癌患者及52例聲帶息肉患者血清中miR-21的表達，發現喉鱗狀細胞癌患者血清中miR-21表達量顯著增高，可作為喉鱗狀細胞癌標記物及預后的獨立因子。提示miR-21在喉鱗癌細胞中起致癌miRNA作用，并與喉鱗癌的發生、發展密切相關。此外，miR-21反寡義核苷酸既能在體外顯著抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，誘導細胞凋亡，并能在體內抑制SiHa細胞裸鼠移植瘤生長，促進其凋亡[6-7]。miR-21 inhibitor亦對胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、舌鱗狀細胞癌細胞具有增殖抑制及凋亡誘導作用[8-10]。說明下調miR-21表達能顯著地影響多種腫瘤細胞的增殖與凋亡，同時已報道PTEN、PDCD4、Bcl-2等多個蛋白是miR-21在不同腫瘤細胞中的靶基因，通過靶向調節靶基因表達，影響腫瘤細胞的增殖凋亡等行為[11]。所以本研究在此基礎上，探討miR-21是否通過調節相關靶蛋白的表達，從而影響喉鱗癌細胞Hep2的增殖與凋亡。

細胞的凋亡受細胞凋亡基因嚴格調控，其中研究最為廣泛的是Bcl-2家族，Bcl-2可顯著促進癌細胞的生長增殖并阻滯癌細胞凋亡，在喉鱗癌組織呈高表達[12]。Bax是Bcl-2家族成員，與Bcl-2形成二聚體，維持細胞增殖凋亡平衡，Bax在喉鱗癌組織中低表達，并參與喉癌細胞凋亡的調控[13]。PDCD4是新近發現的抑癌基因，可通過誘導腫瘤細胞凋亡或阻滯細胞周期，從而抑制腫瘤細胞的生長，其在人乳腺癌、肺癌、腸癌、喉癌等腫瘤中低表達，甚至缺失，與腫瘤的發生、發展密切相關[14-16]。因此上調Bax及PDCD4表達，下調Bcl-2表達，能有效地促進喉癌細胞凋亡，從而抑制癌細胞增殖。本研究結果表明，miR-21 inhibitor能顯著抑制Hep2細胞克隆，誘導細胞凋亡，下調Bcl-2的表達，上調Bax及PDCD4的表達。

腫瘤的增殖與凋亡受眾多信號通路調控，PI3K/AKT信號通路就是其中一種，其具有抗凋亡通路之稱，能與多種人類腫瘤的發生、發展密切相關，能通過下游多種靶蛋白表達，如Bcl-2、PDCD4等，參與調控腫瘤細胞生長、凋亡、血管生成及侵襲等過程。PI3K/AKT上游蛋白PTEN是miR-21的下游靶基因，在眾多腫瘤中表達低下，缺失或突變。PTEN能將三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化為二磷酸脂酰肌醇(PIP2)，從而負調控PI3K/AKT信號通路，在細胞凋亡中起重要作用。已報道PI3K/AKT在喉鱗癌中異常激活[17]。下調miR-21的表達可通過PTEN/AKT信號通路抑制白血病K562細胞增殖及遷移[18]。推測miR-21也能通過PTEN/PI3K/AKT信號通路影響喉癌細胞增殖凋亡等生物學行為。因此，本研究通過Western blot檢測miR-21轉染后，細胞中此信號通路蛋白的表達情況，結果表明，miR-21 inhibitor能顯著上調PTEN表達，降低AKT磷酸化水平，從而提示miR-21表達量下調后能通過PTEN/AKT信號通路抑制喉鱗癌細胞Hep2增殖并誘導細胞凋亡。

綜上所述，miR-21 inhibitor能顯著的誘導喉鱗癌細胞Hep2凋亡，并抑制其克隆形成，與下調Bcl-2表達、上調Bax及PDCD4表達有關，可能是通過PTEN/AKT信號通路實現。

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·經驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.034

曲莉(1980-)，碩士，主治醫生，主要從事耳鼻喉疾病的研究。

R739.65

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1671-8348(2016)24-3411-03

2016-03-04

2016-05-24)