α-胞襯蛋白siRNA對人涎腺導管細胞的影響*

龐春艷，王　蓓，劇錦哲，王永福

(內蒙古科技大學包頭醫學院風濕免疫研究所/包頭醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，內蒙古包頭 014010)

?

α-胞襯蛋白siRNA對人涎腺導管細胞的影響*

龐春艷，王蓓，劇錦哲，王永福△

(內蒙古科技大學包頭醫學院風濕免疫研究所/包頭醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，內蒙古包頭 014010)

目的觀察α-胞襯(α-Fodrin)蛋白小干擾RNA(siRNA)對人涎腺導管(HSG)細胞的影響，探討α-Fodrin siRNA治療干燥綜合征(SS)的作用。方法實驗分對照組、空載體組、α-Fodrin siRNA1組及α-Fodrin siRNA2組，將成功構建的10 μg α-Fodrin siRNA1和α-Fodrin siRNA2表達載體分別采用脂質體法轉染HSG細胞，空載體組HSG細胞轉染等劑量的pGFP-V-RS空載體。轉染后24、48、72和96 h觀察細胞轉染效率，實時熒光定量(RT)-PCR法檢測4組HSG細胞中α-Fodrin mRNA的表達水平；細胞熒光免疫法檢測4組細胞中α-Fodrin蛋白的表達水平；ELISA法檢測4組細胞上清液中IFN-γ、IL-10的表達水平。結果轉染后48 h HSG細胞轉染效率最高；轉染后48 h α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組 HSG細胞中α-Fodrin mRNA和蛋白的表達水平明顯低于對照組和空載體組(P<0.05)，且α-Fodrin siRNA2組中α-Fodrin mRNA的表達水平低于α-Fodrin siRNA1組的表達水平(P<0.05)；α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組細胞上清液中IL-10的水平明顯升高，較對照組和空載體組差異有統計學意義(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組比較差異無統計學意義(P>0.05)；α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組細胞上清中IFN-γ的水平低于對照組和空載體組，但 4組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論HSG細胞轉染α-Fodrin siRNA載體后，α-Fodrin mRNA和蛋白的表達水平下降，同時細胞上清中IL-10的水平升高、IFN-γ水平下降，提示α-Fodrin siRNA可以減輕炎性反應，為SS的治療提供實驗依據。

RNA,小分子干擾；α-胞襯蛋白；人涎腺導管細胞；白細胞介素-10；干擾素-γ

α-胞襯(α-Fodrin)蛋白是從干燥綜合征(sj?gren′s syndrome，SS)小鼠唇腺中提取的涎腺特異性自身抗原，在SS的發病過程中起非常重要的作用，對SS的診斷和指導治療都起到了很好的作用，有較好的特異度和靈敏度[1-2]。人涎腺導管(human salivary gland cells,HSG)細胞來源于人下頜下腺的閏管上皮，常作為研究SS的細胞模型。本研究采用小干擾RNA(siRNA)技術沉默HSG細胞中α-Fodrin 基因的表達，探討α-Fodrin基因的siRNA對HSG細胞的可能作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑載體pGFP-V-RS和TRIzol分別購自Origene和Takara公司，M-MLV逆轉錄酶、脂質體lipofectamineTM2000和標記有紅色熒光的二抗購自Invitrogen公司，ELISA試劑盒為RD國內分裝試劑盒，購自上海生工生物工程有限責任公司，兔抗人的一抗購自Abcam公司。

1.2siRNA的設計針對人α-Fodrin基因的cDNA序列(序列號:XM_006717254)，根據siRNA靶點設計軟件(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/)設計2段siRNA序列，分別位于全序列的第238～256位和第405～423位，第1段序列為：CCC TTA GGC GTC AGA AGC T，第2段序列為：GCT GAA GTG CAG GCC AAC T，這2段siRNA序列的GC含量是一樣的，只是在人α-Fodrin全序列的位置不同。本實驗將上述2段序列的模板插入質粒載體pGFP-V-RS的啟動子下游，構建2段α-Fodrin 的siRNA真核表達載體。

1.3細胞水平的各項檢測本實驗分4組，分別為對照組、空載體組、α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組，將α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組中的HSG細胞分別轉染α-Fodrin siRNA1和α-Fodrin siRNA2真核表達載體10 μg和脂質體lipofectamineTM2000的混合物(比例為1∶3)，對照組轉染等劑量空載體與lipofectamineTM2000的混合物(比例為1∶3)。轉染48 h后，采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，實時熒光定量(RT)-PCR法檢測各組細胞中α-Fodrin mRNA和內參GAPDH的Ct值，計算2-ΔΔCt。同時，4組細胞做細胞熒光免疫檢測染色，圖片采用IPP6軟件分析平均OD值；ELISA法檢測細胞上清中IFN-γ和IL-10的變化，根據標準曲線計算出IFN-γ和IL-10的水平。

2　結　　果

2.1成功構建α-Fodrin的siRNA真核表達載體構建的2段α-Fodrin siRNA真核表達載體送invitrogen公司進行DNA基因測序分析，結果顯示α-Fodrin的2段siRNA序列已準確無誤地插入質粒載體pGFP-V-RS中，見圖1。

2.2熒光顯微鏡觀察HSG細胞轉染效率α-Fodrin的siRNA真核表達載體和空載體轉染后24、48、72、96 h熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光，結果顯示轉染后48 h綠色熒光最亮最多，見圖2，即細胞轉染效率最高。

2.3α-Fodrin的siRNA真核表達載體轉染48 h后α-Fodrin mRNA的表達水平HSG細胞轉染48 h后，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組α-Fodrin mRNA的表達明顯低于對照組和空載體組，差異有統計學意義(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4α-Fodrin的siRNA真核表達載體轉染48 h后α-Fodrin蛋白的表達水平HSG細胞轉染48 h后，細胞熒光免疫的結果顯示：α-Fodrin siRNA1組的平均OD值為(0.011 9±0.000 6)，α-Fodrin siRNA2組的平均OD值為(0.008 6±0.000 6)，對照組的平均OD值為(0.014 7±0.000 7)和空載體組的平均OD值為(0.016 7±0.001 9)，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組α-Fodrin蛋白的表達低于對照組和空載體組，差異有統計學意義(P<0.05)，同時α-Fodrin siRNA2組的α-Fodrin蛋白的表達低于siRNA1組，差異也有統計學意義(P<0.05)，對照組和空載體組α-Fodrin蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

A:α-Fodrin siRNA1組；B:α-Fodrin siRNA2組。

圖1α-Fodrin的siRNA真核表達載體(10×20)

A：HSG細胞的明視野；B：A對應的綠色熒光。

圖2　　HSG細胞的轉染效率(10×20) 表1　　4組細胞中α-Fodrin mRNA表達水平

A：對照組；B：空載體組；C：α-Fodrin siRNA1組；D：α-Fodrin siRNA2組。

圖34組HSG細胞中α-Fodrin蛋白的表達水平

2.5α-Fodrin的siRNA真核表達載體轉染48 h后細胞上清中IFN-γ的表達水平細胞轉染48 h后α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組細胞上清中IFN-γ的水平低于對照組和空載體組，但差異無統計學意義(P>0.05)，4組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2　　4組細胞上清中IFN-γ表達水平

2.6α-Fodrin的siRNA真核表達載體轉染48 h后細胞上清中IL-10的表達水平細胞轉染48 h后α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組細胞上清中IL-10的水平高于對照組和空載體組，差異有統計學意義(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3　　4組細胞上清中IL-10表達水平

3　討　　論

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術自發現以來就引起了研究者的極大關注，因其具有高效性、特異性等優點，這使得RNAi技術廣泛用于基因功能和治療多種疾病等方面的研究，尤其是用于治療自身免疫性疾病[3-5]、腫瘤[6-7]的研究。Pauley等[3]將 caspase-3的特異性siRNA序列和M3受體激動劑膽堿連接，轉染HSG細胞，以受體介導的細胞內吞的方式將siRNA帶入HSG細胞內，它可以明顯抑制caspase-3在基因和蛋白水平的表達。Yu等[8]構建TNF-α siRNA的腺病毒載體注射小鼠，可有效沉默小鼠假體周圍組織中的TNF-α的表達，從而抑制骨溶解。

Fodrin在大多數哺乳動物細胞均有表達，本研究成功構建的2段siRNA真核表達載體并轉染HSG細胞，結果發現α-Fodrin siRNA1組和siRNA2組中HSG細胞的α-Fodrin mRNA的表達與對照組和空載體組比較明顯下降，充分說明α-Fodrin的特異性siRNA能在基因水平上沉默其表達。本研究進一步采用細胞熒光免疫法檢測HSG細胞中α-Fodrin的蛋白表達情況，結果顯示：α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組α-Fodrin的蛋白表達水平與對照組和空載體組比較明顯減弱，差異有統計學意義，說明α-Fodrin siRNA能抑制α-Fodrin在蛋白水平的表達。

Th依據分泌細胞因子模式的不同分為Th1和Th2，Th1主要分泌IFN-γ等，Th2主要分泌IL-4、IL-6等，Th1和Th2在體內保持平衡，二者的失衡在自身免疫病的發病機制中具有重要作用[9-11]。本研究結果發現，與對照組比較，α-Fodrin的siRNA作用HSG細胞后，IL-10的水平明顯升高，而IFN-γ的水平下降，但不明顯。提示α-Fodrin的siRNA可以減輕炎性反應，同時逆轉HSG細胞中Th1和Th2的失衡，使二者保持平衡。

本實驗設計的第2段siRNA序列抑制α-Fodrin mRNA和蛋白水平的表達作用強于第1段siRNA序列，差異有統計學意義，而兩段siRNA序列對IFN-γ和IL-10的作用沒有明顯差別。提示本實驗的第2段siRNA序列具有更好的基因沉默效果，但對炎性反應的作用沒有明顯差別。本研究結果發現，α-Fodrin的siRNA可以降低Th1細胞相關的細胞因子，升高Th2細胞相關的細胞因子，逆轉Th1和Th2的失衡，保持Th1和Th2的平衡。本課題組從細胞水平觀察了α-Fodrin siRNA對HSG細胞的作用，為SS的基因治療提供實驗依據。

本研究采用構建α-Fodrin siRNA質粒載體轉染細胞，轉染后48 h轉染效率最高，但經流式細胞術鑒定也只能達到40% 左右，因此，α-Fodrin siRNA雖然能抑制α-Fodrin mRNA和蛋白水平的表達，但檢測細胞上清中細胞因子卻沒有明顯的改變，可能和其轉染效率不是很高有關系。接下來本研究團隊將構建腺病毒載體，從而大幅度提高其感染HSG細胞的效率，進一步檢測細胞上清中細胞因子、細胞周期和細胞凋亡的變化，進行深入研究。此外，本研究只是通過檢測部分細胞因子的表達而間接推測T細胞亞群的變化，而不是直接證明T細胞亞群的變化，因此是不充分的。后續本團隊將研究siRNA對SS患者的外周血單個核細胞或SS動物模型NOD小鼠脾細胞的作用，從而直接說明siRNA對T細胞亞群的影響。

[1]秦琴，孫懿，谷明莉，等．抗α-胞襯蛋白抗體對干燥綜合征的診斷價值:一項Meta分析[J]．檢驗醫學，2012，27(12)：1074-1079．

[2] Witte T．Diagnostic markers of Sjogren′s syndrome [J]．Dev Ophthalmol,2010,45:123-128．

[3]Pauley KM,Gauna AE,Grichtchenko II,et al.A secretagogue-small interfering RNA conjugate confers resistance to cytotoxicity in a cell model of Sjogren′s syndrome[J].Arthritis Rheum,2011,63(10):3116-3125.

[4]Komano Y,Yagi N,Onoue I,et al.Arthritic joint-targeting small interfering RNA-encapsulated liposome:implication for treatment strategy for rheumatoid arthritis[J].J Pharmacol Exp Ther,2012,340(1):109-113.

[5]Zhou Z,Li A,Wang Z,et al.Blimp-1 siRNA inhibits B cell differentiation and prevents the development of lupus in mice[J].Hum Immunol,2013,74(3):297-301.

[6]Gao FL,Li WS,Liu CL,et al.Silencing bmi-1 enhances the senescence and decreases the metastasis of human gastric cancer cells[J].World J Gastroenterol,2013,19(46):8764-8769.

[7]袁麗華，郭武華，肖志華，等．SUMO-1基因沉默對肝癌細胞株SMMC-7721bcl-2及c-myc基因表達的影響[J]．重慶醫學，2010，39(19)：2578-2580．

[8]Yu B,Hao S,Sun S,et al.Experimental study on small interfering RNA silencing expression of tumor necrosis factor alpha and inhibiting osteolysis[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2013,27(8):994-999.

[9]Gor DO,Rose NR,Greenspan NS.TH1-TH2:a procrustean paradigm[J].Nat Immunol,2003,4(6):503-505.

[10]Mitsias DI,Tzioufas AG,Veiopoulou C,et al.The Th1/Th2 cytokine balance changes with the progress of the immunopathological lesion of Sjogren′s syndrome[J].Clin Exp Immunol,2002,128(3):562-568.

[11]Garcíc-Carrasco M,Font J,Filella X,et al.Circulating levels of Th1/Th2 cytokines in patients with primary Sjogren′s syndrome:correlation with clinical and immunological features[J].Clin Exp Rheumatol,2001,19(4):411-415.

論著·臨床研究

論著·基礎研究

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.006

Effect of α-Fodrin siRNA on human salivary gland cells*

PangChunyan,WangBei,JuJinzhe,WangYongfu△

(InstituteofRheumatologyofBaotouMedicalCollege,InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology/DepartmentofRheumatology,theFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou,Mongolia014010,China)

ObjectiveTo observe the effect of α-Fodrin siRNA on human salivary gland(HSG)cells and to discuss its therapy on sj?gren′s syndrome(SS).MethodsThe vectors expressing siRNA against α-Fodrin of human were transfected into HSG cells of 10 μg α-fodrin siRNA1 group and α-Fodrin siRNA2 group,while pGFP-V-RS vector were transfected into the cells of empty vector group，there was no handling in HSG cell of control group.The efficiency was observed by fluorescence microscope after transfection of 24,48,72 and 96 h by lipofectamine 2000.The expression levels of α-Fodrin mRNA and protein of HSG were detected by real-time(RT)-PCR and immunohistochemistry method respectively.The expression levels of IFN-γ and IL-10 in supernatant of cells were detected by ELISA.ResultsThe efficiency was highest on 48 h after transfection.The level of α-Fodrin mRNA and protein was lower in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group than control group and empty vector group on 48 h after transfection (P<0.05),the level of α-Fodrin mRNA in α-fodrin siRNA2 group was significant higher than α-fodrin siRNA1 group (P<0.05).The levels of IL-10 were higher in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group than control group and empty vector group on 48 h after transfection (P<0.05),α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group had no statistical significance(P>0.05).The levels IFN-γ in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group were lower than of control group and empty vector group on 48 h after transfection,but there were no significant differences in the four groups (P>0.05).ConclusionThe α-fodrin siRNA1 and α-fodrin siRNA2 can suppress the levels of α-fodrin mRNA and protein of HSG cells,at the same time;they can elevate the expression of IL-10 and decrease the level of IFN-γ.So α-Fodrin siRNA reduce the levels of inflammatory cytokines and provide experimental basis to therapy of SS.

RNA,small interfering;α-Fodrin protein;human salivary gland cells;interleukin-10;interferon-γ

包頭市醫藥衛生基金項目(2009S1001-34)；內蒙古自治區科技計劃項目(20120403)。作者簡介：龐春艷(1978-)，主管檢驗師，碩士，主要從事免疫性疾病研究工作。△

，E-mail:wyf5168@hotmail.com。

R373.9

A

1671-8348(2016)07-0880-03

2015-09-18

2015-11-28)

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.007

胡輔華(1973-)，副主任醫師，碩士，主要從事眼科疾病研究工作。