氫飽和生理鹽水對大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷的保護作用*

楊　培,冷　波,李　波，曾新桃,羅　華

(1.四川省綿陽市中心醫院肝膽外科　621000;2.西南醫科大學附屬醫院肝膽外科,四川瀘州 646000)

?

論著·基礎研究

氫飽和生理鹽水對大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷的保護作用*

楊培1,冷波2△,李波2，曾新桃1,羅華1

(1.四川省綿陽市中心醫院肝膽外科621000;2.西南醫科大學附屬醫院肝膽外科,四川瀘州 646000)

目的探討靜脈注射氫飽和生理鹽水(HRS)對?；悄懰徕c誘導的大鼠重癥急性胰腺炎相關性肺損傷(APALI)是否具有保護作用及其可能的機制。方法將54只健康SD雄性大鼠分成假手術組(Sham組)、模型組(SAP+NS組)和HRS處理組(SAP+HRS組)，各組再按時間點每個亞組分成6、12、24 h 3個亞組，每個時間點處死6只大鼠。收集血清、肺組織及胰腺組織。檢測血清TNF-α、IL-1β水平；肺組織濕干質量比；測定肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達；并對胰腺組織、肺組織損傷進行病理學評價。結果(1)SAP+NS組和SAP+HRS組血清中TNF-α、IL-1β水平、胰腺和肺組織病理評分、肺組織TNF-α、IL-1β mRNA的表達，肺組織濕干質量比在6、12、24 h各個時間點均高于Sham組(P<0.05)。(2)SAP+HRS組與SAP+NS組比較，SAP+HRS組血清TNF-α水平、肺組織TNF-α mRNA的表達、肺組織濕干質量比在各個時間點均低于SAP+NS組(均P<0.05)。血清IL-1β水平、胰腺和肺組織病理評分、肺組織中IL-1β mRNA表達在6 h時兩組間差異無統計學意義(P>0.05)，但在12、24 h時SAP+HRS組低于SAP+NS組(均P<0.05)。結論HRS可能是通過其選擇性抗氧化作用抑制了氧化應激損傷相關細胞因子表達來實現對APALI的保護。

胰腺炎,急性壞死性；呼吸窘迫綜合征,成人；氫飽和生理鹽水；大鼠,sprague-dawley

急性胰腺炎相關性肺損傷(acute pancreatitis associated lung injury,APALI)[1]是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreastitis，SAP)最常見、也是最為嚴重的并發癥之一，常發展為急性呼吸窘迫綜合征，是SAP早期主要死亡原因。研究表明，氧化應激反應在胰腺損傷及伴隨的局部或全身并發癥中起著至關重要的作用[2]。因此，抗氧化應激治療可能是減輕SAP病情發展的重要手段。本實驗通過建立大鼠SAP模型，探討靜脈注射氫飽和生理鹽水(hydrogen-rich saline，HRS) 是否對APALI具有保護作用，并從炎癥細胞因子的變化方面初步探討其保護機制，旨在為應用HRS治療APALI提供實驗依據和新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組SPF級健康成年雄性SD大鼠由瀘州醫學院實驗動物飼養中心提供，體質量200～250 g，分為假手術組(Sham組)、模型組(SAP+NS組)及HRS處理組(SAP+HRS組)，每組18只。各組再分成處理后6、12、24 h 3個時間點，各6只大鼠。

1.1.2主要儀器和試劑DH-300超高純度氫氣發生器(廣州深華生物技術有限公司)、大鼠TNF-α、IL-1β試劑盒(Bender公司)、PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型的建立Sham組大鼠開腹后翻動十二指腸并觸摸胰腺數次,隨即關腹，不做其他處理。采用膽胰管逆行緩慢注入(0.1 mL/min)5%無菌牛磺膽酸鈉(1 mL/kg)的方法制備大鼠SAP模型[3]。SAP+NS組和SAP+HRS處理組在大鼠SAP模型建模成功后1 h分別經尾靜脈注射生理鹽水或HRS(5 mL/kg)。

1.2.2標本采集按規定時間點處死大鼠。心臟采血3～4 mL,4 ℃、12 000 r/min低溫高速離心得血清1.5～2.0 mL,-20 ℃保存備用。取大鼠右肺上葉和部分胰腺組織置于10%甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋,4 ℃保存,然后4 μm切片,蘇木素-伊紅(HE)染色用于病理學評價。大鼠右肺中葉置于液氮中,-80 ℃保存備用,分別用于TNF-α、IL-1β mRNA等分子生物學檢測。取右肺下葉濾紙吸干表面滲液及血跡,稱濕質量后置于80 ℃干燥箱內烘烤72 h至恒重后稱質量,用于計算肺臟濕干質量比。

1.3觀測指標

1.3.1血清TNF-α、IL-1β水平采用ELISA法測定血清中TNF-α、IL-1β水平。

1.3.2胰腺、肺組織病理損傷評價在雙盲條件下，由兩名經驗豐富的病理科醫師獨立閱片。采用改良Schmidt評價標準[4]對胰腺組織損傷進行病理學計分。參照Hofouaer方法[5],對肺組織損傷進行病理學評價。每張切片隨機選取5個視野,取其平均分作為該切片的病理損傷評分,代表其損傷程度。

1.3.3肺組織濕干質量比取右肺下葉進行測量，反映組織水腫程度。

1.3.4肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達采用熒光定量PCR法檢測。

2　結　　果

2.1血清中TNF-α的水平變化SAP+NS組和SAP+HRS組大鼠血清中TNF-α水平在6、12、24 h 3個時間點均高于Sham組,但SAP+HRS組均低于SAP+NS組，差異有統計學意義(均P<0.05)，見表1。

2.2血清中IL-1β的水平變化SAP+NS組和SAP+HRS組大鼠血清中IL-1β水平在6、12、24 h 3個時間點均高于Sham組。SAP+HRS組與SAP+NS組比較，6 h時SAP+HRS組略高于SAP+NS組，但差異無統計學意義(P>0.05)；12、24 h時SAP+HRS組均低于SAP+NS組，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表1　　各組大鼠血清TNF-α水平比較

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

表2　　各組大鼠血清IL-1β水平比較

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

2.3胰腺和肺組織病理損傷評分在6、12、24 h 3個時間點，SAP+NS組和SAP+HRS組胰腺組織、肺組織病理損傷評分均高于Sham組(P<0.05)。SAP+HRS組與SAP+NS組比較，6 h時兩組差異無統計學意義(P>0.05)；12、24 h時SAP+HRS組均低于SAP+NS組，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3　　各組胰腺和肺組織病理評分比較±s，分)

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

表4　　各組肺組織濕干質量比比較±s)

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

2.4肺組織濕干質量比的變化在6、12、24 h 3個時間點，SAP+NS組和SAP+HRS組肺組織濕干質量比均高于Sham組(P<0.05)。SAP+HRS組與SAP+NS組比較，SAP+HRS組各時間點均低于SAP+NS組(P<0.05)。見表4。

2.5肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達變化在6、12、24 h 3個時間點，SAP+NS組和SAP+HRS組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA表達水平均高于Sham組(P<0.05)。

表5　　各組肺組織TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達水平的比較

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

SAP+HRS組與SAP+NS組比較，各時間點SAP+HRS組TNF-α mRNA均低于SAP+NS組(P<0.05)。6 h時兩組IL-1β mRNA差異無統計學意義(P>0.05)；12、24 h時SAP+HRS組IL-1β mRNA明顯低于SAP+NS組(均P<0.05)。見表5。

3　討　　論

APALI的發病機制復雜，目前尚未完全明確。既往研究顯示，炎癥通路過度活化與SAP 時多器官功能損傷關系密切，IL-1β、TNF-α等細胞因子在SAP 早期表達明顯增加,且表達量的增加與病情嚴重程度和預后明顯相關[6]。TNF-α等是促炎細胞因子，還能促進其他細胞因子如IL-6、IL-8等形成，其表達水平上調會導致組織受損、微循環障礙，誘發多器官功能障礙[7]。因此，抑制促炎細胞因子的活化可能對APALI起到保護作用。2007年日本學者Ohsawa等[8]發現氫氣具有選擇性抗氧化作用，可以選擇性中和毒性作用強的羥自由基和亞硝酸陰離子，而后兩者是氧化應激的重要介質，目前體內尚未找到特異性清除途徑。該研究迅速引起國內外學者的廣泛關注，掀起了研究氫分子生物學的熱潮。而后在肝、腎、心肌、腦、小腸等[9-13]器官的缺血再灌注模型中,也相繼發現氫氣在細胞保護和臟器損傷防護中發揮著明顯抗氧化和抗炎作用。

本實驗在建立大鼠SAP模型的基礎上，經尾靜脈注射HRS觀察其治療效果及對炎癥細胞因子的影響。結果顯示：SAP+HRS組肺組織病理損傷評分和肺水腫指標(肺濕干質量比)明顯優于SAP+NS組，說明HRS能顯著改善肺組織炎癥損傷程度，對肺組織損傷具有保護作用。SAP+HRS組6、12、24 h時血清中TNF-α的水平均低于SAP+NS組，差異有統計學意義，表明HRS對TNF-α炎癥因子有明顯抑制作用；SAP+HRS組在6 h時血清中IL-1β水平與SAP+NS組差異無統計學意義(P>0.05)，隨著時間的變化，在12、24 h時均低于SAP+NS組，表明HRS對IL-1β炎癥因子同樣具有抑制作用。再采用熒光定量PCR法對肺組織中TNF-α、IL-1β的核酸水平(TNF-α、IL-1β mRNA)進行檢測時發現，SAP+HRS組在6、12、24 h時肺組織中TNF-α mRNA的表達均低于SAP+NS組；SAP+HRS組在6 h時肺組織中IL-1β mRNA表達與SAP+NS組差異無統計學意義(P>0.05)，但隨著時間的延長，12、24 h時均低于SAP+NS組，表明HRS對肺組織中的TNF-α、IL-1β mRNA合成均有抑制作用，提示HRS可能從基因水平抑制炎癥細胞因子的生成。

綜上所述，本實驗發現靜脈注射HRS對血清中TNF-α、IL-1β水平及肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA水平表達具有明顯抑制作用，相應的肺組織及胰腺組織病理損傷評分降低，肺濕干質量比降低，提示HRS可能通過其選擇性抗氧化應激作用下調血清和肺組織中TNF-α、IL-1β的表達，改善肺組織的病理損傷，從而對APALI起到一定的保護作用。但其具體的作用機制，如基因層面如何進行調控等還有待進一步研究明確。

[1]Chooklin S.Pathogenic aspects of pulmonary complications in acute pancreatitis patients[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2009,8(2):186-192．

[2]Wood KM.The hydrogen highway to reperfusion therapy[J].Nat Med,2007,13(6):673-674.

[3]Bluth MH,Patel SA,Dieckgraefe BK,et al.Pancreatic regenerating protein (reg Ⅰ) and reg Ⅰ receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis[J].World J Gastroenterol,2006,12(28):4511-4516.

[4]Riegert-Johnson DL,Godfrey JA,Myers JL,et al.Delayed hypersensitivity reaction and acute respiratory distress syndrome following infliximab infusion[J].Inflammatory Bowel Dis,2002,8(3):186-191.

[5]Hofbauer B,Saluja AK,Bhatia M,et al.Effect of yecombinant Platelet activating factor acetylhydrolase on two Models of experiment acute Panereatitis[J].Gastroenierology,1998,115(5):1238-1247.

[6]Jha RK,Ma Q,Lei Z,et al.Resveratrol ameliorates the deleterious effect of severe acute pancreatitis[J]．Cell Biochem Biophys,2012,62(2):397-402.

[7]Zhou MT,Chen BC,Sun HW,et al.Continuous regional arterial infusion with fluorouracil and octreotide attenuates severe acute pancreatitis in a canine model[J].PLoS One,2012,7(5):e37347.

[8]Ohsawa I,Ishikawa M,Takahashi K,et al.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J].Nat Med,2007,13(6):688-694.

[9]Tan YC,Xie F,Zhang HL，et al.Hydrogen-rich saline attenuates postoperative liver failure after major hepatectomy in rats[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol，2014,38(3):337-345.

[10]Hong Y,Shao A,Wang J,et al.Neuroprotective effect of hydrogen-rich saline against neurologic damage and apoptosis in early brain injury following subarachnoid hemorrhage:possible role of the Akt/GSK3β signaling pathway[J].PLoS One,2014,9(4):e96212.

[11]Li H,Zhou R,Liu J.Hydrogen-rich saline attenuates lung ischemia-reperfusion injury in rabbits[J].J Surg Res,2012,174(1):e11-16.

[12]Shigeta T,Sakamoto S,Li XK,et al.Luminal injection of hydrogen-rich solution attenuates intestinal ischemia-reperfusion injury in rats[J].Transplantation,2015,99(3):500-507.

[13]Gu H,Yang M,Zhao X,et al.Pretreatment with hydrogen-rich saline reduces the damage caused by glycerol-induced rhabdomyolysis and acute kidney injury in rats[J].J Surg Res,2014,188(1):243-249.

Protective effect of hydrogen-rich saline solution on lung injury in rats with severe acute pancreatitis*

YangBei1,LengBo2△,LiPo2,ZengXintao1,LuoHua1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,MianyangCentralHospital,Mianyang,Sichuan621000,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo explore whether intravenous injection of hydrogen-rich saline having the protective effect on sodium taurocholate induced severe acute pancreatitis(SAP) associated lung injury(APALI) in rats and its possible mechanisms.MethodsFifty-four healthy male SD rats were randomly divided into sham-operation group (Sham group),model group (SAP+NS group) and hydrogen water treatment group (SAP + HRS group),and each group was subdivided into 6,12,24 h subgroups.Six rats were killed at each time point for collecting serum,lung tissue and pancreas tissue.Serum TNF-α and IL-1β levels,lung wet /dry weight ratio,expression of TNF-α mRNA and IL-1β mRNA in the lung tissue were detected.The pathological evaluation of pancreas and lung tissue injury was performed.Results(1)The levels of TNF-α and IL-1β in serum,pancreas and lung tissue pathological scores,TNF-α mRNA and IL-1β mRNA expression levels in the lung tissue and lung wet dry weight ratio at the time points of 6,12,24 h in the SAP+NS group and the SAP+HRS group were higher than those in the sham group (P<0.05).(2) Compared with the SAP+NS group,the levels of serum TNF-α,TNF-α mRNA expression level in the lung tissue and lung wet dry weight ratio at all time points in the SAP+HRS group were lower(P<0.05);the levels of serum IL-1β,pancreas and lung tissue pathological score and IL-1β-mRNA expression at 6 h in the lung tissue had no statistical difference between the SAP+NS group and SAP+HRS group,but which at time points of 12,24 h in the SAP+HRS group were lower than those in the SAP+NS group(P<0.05).ConclusionHRS realize the protection on APALI possibly via its elective anti-oxidation action for inhibiting oxidative stress injury related cytokines expression.

pancreatitis,acute necrotizing;respiratory distress syndrome,adult;hydrogen-rich saline；rats,sprague-dawley

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.005

四川省科技廳應用基礎研究計劃資助項目(2012JY0070)。作者簡介：楊培(1972-)，主任醫師，博士，主要從事肝膽外科學研究?！?/p>

，E-mail:305827337@qq.com。

R576

A

1671-8348(2016)12-1598-03

2015-12-08

2016-01-12)