平消膠囊(片)HPLC特征圖譜研究

劉　越，羅定強*，康　榮，王國海

(1.陜西省食品藥品檢驗所，西安　710065；2.西安醫學院，西安　710021)

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平消膠囊(片)HPLC特征圖譜研究

劉越1，羅定強1*，康榮2，王國海1

(1.陜西省食品藥品檢驗所，西安710065；2.西安醫學院，西安710021)

目的 建立平消膠囊(片)的特征圖譜，提高其質量控制水平。方法以甲醇為溶劑，進行超聲提?。簧V柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-5 mL·L-1磷酸水溶液，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：263 nm；柱溫:35 ℃。結果平消膠囊(片)各成分得到了較好的分離，以柚皮苷為參照物，確定了9個共有色譜峰，分別來源于馬錢子、枳殼和五靈脂。結論該方法準確、重復性好，可同時分離平消制劑中的多種成分，尤其是對現有標準方法中枳殼主要成分柚皮苷薄層鑒別項易出現假陽性結果的現象進行補充。

平消膠囊(片)；特征圖譜；枳殼；質量控制

平消膠囊(片)為2013年國家藥品計劃抽驗品種，現行質量標準收載于《中國藥典》2015年版一部，主要由郁金、仙鶴草、五靈脂、白礬、硝石、干漆(制)、枳殼(麩炒)和馬錢子粉8味中藥組成[1]；具有活血化瘀、散結消腫和解毒止痛的功效；對毒瘀內結所致的腫瘤患者具有緩解癥狀、縮小瘤體、提高人體免疫力和延長患者生存時間的作用。平消制劑是經臨床實踐確證的抗癌藥，尤其是對乳腺癌、肺癌和食道癌等惡性腫瘤具有較好的療效[2]?，F行的標準方法較簡單，鑒別項中只對馬錢子和枳殼進行了控制，含量測定項下只對馬錢子藥材成分中的士的寧進行含量測定，難以有效控制平消膠囊(片)的質量，且枳殼混偽品種較多[3]，多含有與柚皮苷結構類似的黃酮類化合物[4-5]，依據現行標準方法使用硅膠G為吸附劑，乙酸乙酯-甲酸-水三項系統為展開劑，很難有效分離上述黃酮類化合物，容易造成假陽性結果。

作為能體現中藥整體特征的指紋圖譜和特征圖譜分析技術在近年來的質量標準研究中得到了廣泛的關注和認可[6-9]。本文對平消膠囊(片)的HPLC 特征圖譜進行了系統地方法學考察，并對實驗結果進行了分析總結，以期合理提高該制劑的質控標準。

1　儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器(日本島津公司)；BS224S電子分析天平、BP211D電子分析天平(德國塞多利斯公司)；KQ-500DE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥馬錢子堿對照品(批號110706-200505)，士的寧對照品(批號110705-201307)，柚皮苷對照品(批號110722-201312)，新橙皮苷對照品(批號111857-201001)，橙皮苷對照品(批號110721-201316)，馬錢子對照藥材(批號121164-200302)，枳殼對照藥材(批號120981-200403)，五靈脂對照藥材(批號121348-200501)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；平消膠囊(片)樣品來源于市場抽樣；生產用藥材、陰性樣品由生產企業提供；甲醇(色譜純，Merck公司)；水為超純水；其余試劑為分析純。

2　現行標準方法柚皮苷薄層鑒別假陽性結果

依據現行標準方法，制備供試品溶液。另取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。以硅膠G為吸附劑，以乙酸乙酯-甲酸-水(10∶2∶3)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，晾干，置于紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對照品色譜相應的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點，提示現有的標準方法容易造成柚皮苷鑒別假陽性結果，見圖1。

圖1薄層色譜圖

1.柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.樣品

Fig.1 TLC chromatogram

1.naringin；2.hesperidin；3.neohesperidin；4.sample

3　特征圖譜研究

3.1色譜條件色譜柱(Kromasil C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 mL·L-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：263 nm；分析時間：65 min；進樣量：10 μL；流動相：乙腈-5 mL·L-1磷酸水溶液梯度洗脫，見表1。

表1梯度洗脫程序

Tab.1 The mobile phase program of gradient elution

時間/minA,乙腈/%B,5mL·L-1磷酸水溶液/%01585263070416040568020601585651585

3.2對照品溶液和對照藥材溶液的制備取馬錢子堿、士的寧、柚皮苷和新橙皮苷對照品各5 mg，精密稱定，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成1 mL各含0.1 mg的混合對照品溶液，用于色譜峰定位。另取馬錢子、枳殼和五靈脂對照藥材各1 g，分別加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，取濾液作為對照藥材溶液，用于峰歸屬。

3.3供試品溶液的制備取平消膠囊(片)適量，研細，取1 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質量，搖勻，密塞，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

3.4測定方法分別精密量取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，以柚皮苷色譜峰為S峰，其余各峰的保留時間與S峰保留時間比值為相對保留時間。

3.5方法學考察

3.5.1精密度實驗取同一供試品溶液，在相同色譜條件下連續進樣6 次，測定，記錄色譜圖，以柚皮苷峰為內標準峰。結果表明，各主要色譜峰相對保留時間與其相對峰面積無明顯差異，其RSD值分別為0.1%～0.2% 和0.2%～0.5%，表明本實驗儀器及色譜條件的精密度良好。

3.5.2穩定性實驗取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，18和24 h時測定，記錄色譜圖。結果表明，各主要色譜峰相對保留時間和其相對峰面積無明顯差異，以柚皮苷峰為內標準峰，柚皮苷峰保留時間和峰面積的RSD值分別為0.2%和0.6%，穩定性良好。說明供試品溶液在24 h內穩定。

3.5.3重復性實驗取同一批次的樣品， 按照3.3項下方法制備供試品溶液6份，按照上述色譜條件進樣，測定，記錄色譜圖。結果表明，各主要色譜峰相對保留時間和其相對峰面積無明顯變化，以柚皮苷峰為內標準峰，其RSD值分別為0.6%～0.8%和0.3%～0.5%，重復性良好。

3.5.4色譜峰歸屬取馬錢子堿、士的寧、柚皮苷和新橙皮苷混合對照品溶液以及馬錢子、枳殼和五靈脂對照藥材溶液，按照上述色譜條件進樣，測定，確定各藥材主峰的保留時間，與樣品色譜圖進行比較，結果各藥材主峰均在樣品色譜圖中呈現，且分離度良好，見圖2。

圖2HPLC圖

A.混合對照品；B.樣品；C.薄層鑒別易出現假陽性結果樣品；

1.馬錢子堿；2.士的寧；S.柚皮苷；4.新橙皮苷

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.sample；C.sample of false-positive result；1.brucine；2.strychnine；S.naringin；4.neohesperidin

3.5.5專屬性考察取不含每種藥材的陰性樣品，按照3.3項下方法制備陰性溶液，在相同色譜條件下進樣，按照各峰的保留時間對主要色譜峰進行峰歸屬。

4　樣品特征圖譜的建立

抽取不同生產企業的平消片和平消膠囊樣品共10批，按照3.3項下方法制備供試品溶液，記錄色譜圖，通過對10批樣品的色譜圖進行比較，選定其中9個峰為特征峰，并以柚皮苷峰為S峰，計算其余峰的相對保留時間。平消膠囊(片)特征圖譜見圖2，各峰保留時間及峰歸屬結果見表2。

表2各特征峰的保留時間及歸屬

Tab.2 The retention time and the corresponding medicinal materials of characteristic peaks

峰名稱保留時間相對保留時間對應藥材馬錢子堿7.8830.471馬錢子士的寧8.2350.492馬錢子峰315.4130.921枳殼柚皮苷峰(S)16.7251.000枳殼新橙皮苷18.9231.131枳殼峰528.5231.705枳殼峰640.0752.396枳殼峰741.0672.455五靈脂峰842.7732.557枳殼

5　討論

5.1方法特點本研究建立的平消膠囊(片)特征圖譜，能夠同時控制制劑中馬錢子、枳殼和五靈脂3味藥材的質量，能夠從一定程度上體現出平消制劑不同廠家、不同批次之間的穩定性和均一性。另外，枳殼混偽品種較多，多含有與柚皮苷結構類似的黃酮類成分，現有標準方法薄層鑒別容易造成假陽性結果。新建立的高效液相特征圖譜方法能夠準確地區別上述黃酮類化合物，可用于鑒別制劑中枳殼藥材的混偽品。

5.2色譜峰歸屬制劑中藥材的主要色譜峰在263 nm 處均能體現，且在此波長處檢測的色譜峰數量較多，響應值較好，故選擇263 nm 為檢測波長。在此波長處，3種藥材均有特征峰呈現，根據峰歸屬結果，馬錢子的特征峰為1和2 號峰，分別為馬錢子堿和士的寧，枳殼的特征峰為3，4，5，6和8號峰，S峰柚皮苷和4號峰新橙皮苷為枳殼的主要化學成分，五靈脂藥材的特征峰為7號峰。

5.3平消制劑質量標準結合現有標準方法及平消膠囊(片)特征圖譜，仍不能有效控制該制劑君藥郁金和仙鶴草的質量，同時制干漆為毒性藥材，現行質量標準無相應的檢驗項目，五靈脂僅收載于地方藥材標準，無理化檢驗項目，難以有效控制成品的質量，無法對生產企業可能使用質量不合格的原料藥及偷工減料等問題進行有效監管。另一方面，由于礦物藥白礬和硝石的存在，可能存在重金屬及有害元素超標的隱患，這些問題均有待進一步深入研究。

[1]國家藥典委員會.中國藥典2015年版[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2015：772-773.

[2]劉非，劉健.平消膠囊治療惡性腫瘤研究概況[J].現代腫瘤醫學，2007，15(1)：142-143.

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[7]王術玲，賈薇，高曉玲．柴胡疏肝散水提液HPLC 特征圖譜研究及指標成分的測定[J].中成藥，2012，34(12)：2384-2388.

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HPLC specific chromatograms of Pingxiao Capsules(Tablets)

LIU Yue1，LUO Dingqiang1*，KANG Rong2，WANG Guohai1

(1.Shaanxi Institute for Food and Drug Control，Xi′an 710065，China；2.Xi′an Medical College，Xi′an 710021，China)

Objective To establish the specific chromatogram of Pingxiao Capsules (Tablets) by HPLC，and to improve the quality control.Methods Samples were prepared by ultrasonic extraction with methanol；the Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) chromatographic column and the mobile phase of acetonitrile-5 mL·L-1aqueous phosphoric acid were used for gradient elution with the flow rate at 1.0 mL·min-1and the detection wavelength at 263 nm.The column oven temperature was kept at 35 ℃.Results The constituents of Pingxiao Capsules (Tablets) showed a good separation and nine common peaks were identified with naringin as a reference，which were derived fromStrychnisemen，FructusaurantiiandFaecestrogopterori，respectively.Conclusions The method has advantages of good accuracy as well as reproducibility and can simultaneously separate the multiple components of Pingxiao Capsules (Tablets)，which is also a significant supplement of frequently false-positive results in current standard TLC identification for naringin.

Pingxiao Capsules(Tablets)；specific chromatogram；Fructusaurantii；quality control

國家食品藥品監督管理總局上市藥品質量分析專項項目

劉越，男，博士，主管藥師

羅定強，男，副主任藥師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.003

R284

A

1004-2407(2016)05-0448-04

2016-03-13)