正交實驗法優選健腎Ⅰ號膠囊水煎提取工藝

陳夢鈺，牛倩倩，焦海勝

(1.蘭州大學藥學院，蘭州　730000；2.蘭州大學第二醫院藥學部，蘭州　730030)

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正交實驗法優選健腎Ⅰ號膠囊水煎提取工藝

陳夢鈺1，2，牛倩倩1，焦海勝2*

(1.蘭州大學藥學院，蘭州730000；2.蘭州大學第二醫院藥學部，蘭州730030)

目的優選健腎Ⅰ號膠囊水煎提取工藝。方法采用正交實驗L934法，以干浸膏得率和沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸含量的綜合評分為指標，考察提取時間、液料比和提取次數對提取工藝的影響。結果影響水煎提取工藝的因素次序依次為提取時間(A)>提取次數(C)>液料比(B)。最佳提取工藝條件為A3B1C3，即處方藥材加6倍量水，水煎提取3次，每次3 h。結論優選的水煎提取工藝穩定，合理可行，可用于健腎Ⅰ號膠囊的實際配制。

健腎Ⅰ號膠囊；正交實驗法；水煎提取

健腎Ⅰ號膠囊(Jianshen CapsulesⅠ，JCⅠ)為蘭州大學第二醫院自制的中藥制劑，由忍冬藤、地榆、紅景天、龍葵、烏藥、石韋、海金沙和益智仁8味中藥制成，具有清熱解毒、利濕通淋的功效，主要用于尿道炎、膀胱炎、急性腎盂腎炎和前列腺炎的治療。為了更好地發揮其臨床療效，保證其臨床療效的穩定性，本文用HPLC法同時測定健腎Ⅰ號膠囊中沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸的含量，采用正交實驗法對其提取工藝進行了考察，為臨床應用提供理論依據。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀，G1314B-VWD檢測器，ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱 (美國安捷倫公司，250 mm×4.6 mm，5 μm)；ME215S型吉尼斯系列電子分析天平(德國賽多利斯儀器有限公司)；CQ50超聲波清洗機(上海超聲波儀器廠)；202A-00型恒溫干燥箱(上海新正機械儀器制造有限公司)；BD-11多功能紫外分析儀(北京啟航博達科技有限公司)。

1.2試藥方中藥材均購自甘肅隴脈藥材有限公司，均符合《中國藥典》2010年版一部相關標準；對照品：沒食子酸(批號110831-201204，供含量測定用)，紅景天苷(批號110818-201206，供含量測定用)，綠原酸(批號110753-200413，供含量測定用)，咖啡酸(批號110885-200102，供含量測定用)，均購自中國藥品生物制品檢定研究所；甲醇、乙腈(天津市光復精細化工研究所)為色譜純；水為蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1含量測定

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 供試品溶液的制備 分別稱取正交實驗項下9份供試品浸膏各1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲10 min，提取3次，合并濾液，揮干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，取濾液作為供試品溶液。

2.1.1.2混合對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸對照品，加甲醇制成含沒食子酸2.13 mg·mL-1、紅景天苷0.60 mg·mL-1、綠原酸1.62 mg·mL-1和咖啡酸0.91 mg·mL-1的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.1.1.3陰性樣品溶液的制備取除地榆、忍冬藤、紅景天和石韋外的其他處方藥材，依法制備缺少地榆、忍冬藤、紅景天和石韋的水提取物陰性樣品，按照2.1.1.1項下方法制得陰性樣品溶液。

2.1.2色譜條件色譜柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相[1，3]：乙腈-1 mol·L-1磷酸溶液(5∶95)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長[2-4]：0～28 min(273 nm)，28～60 min(325 nm)；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL。理論板數均不低于3 000，對應色譜峰的分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.沒食子酸；2.紅景天苷；3.綠原酸；4.咖啡酸

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.gallic acid；2.salidroside；3.chlorogenic acid；4.caffeic acid

2.1.3標準曲線的繪制精密量取2.1.1.2項下混合對照品溶液梯度稀釋制成4份不同質量濃度的對照品溶液，分別吸取不同體積的對照品溶液進樣[5-7]，照2.1.2項下色譜條件，以進樣量(μg)對峰面積進行線性回歸，結果見表1。

表1線性關系結果

Tab.1 The results of linear relationship

成分回歸方程r線性范圍/μg沒食子酸Y=2677.8X+129.70.99950.1078～10.65紅景天苷Y=207.93X+1.94820.99990.0101～6.00綠原酸Y=2729.0X-16.8080.99970.0273～8.10咖啡酸Y=4635.3X-28.5050.99980.0154～4.55

2.1.4精密度實驗精密吸取同一水提供試品溶液，按照2.1.2項下色譜條件連續進樣6次，每次進樣5μL。沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD值分別為0.57%，0.65%，0.51%和0.60%(n=6)。

2.1.5重復性實驗取同一批水提供試品溶液，按照2.1.2項下色譜條件，連續進樣測定6次，每次進樣5μL。沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD值分別為0.92%，1.23%，1.01%和1.15%(n=6)。2.1.6穩定性實驗 取同一水提供試品溶液，分別在0，2，4，8，16，24和48h進樣5μL，進行測定，結果沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD值分別為1.29%，0.96%，0.72%和0.75%。

2.1.7回收率實驗稱取已知含量的同一批水提供試品各0.1g，共6份，分別精密加入沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸混合對照品溶液1mL(其中沒食子酸1.12mg·mL-1、紅景天苷0.13mg·mL-1、綠原酸0.12mg·mL-1和咖啡酸0.05mg·mL-1)，按照供試品溶液制備方法和測定條件進行測定，記錄沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸峰面積，計算回收率，結果見表2。

表2加樣回收率實驗結果

Tab.2Theresultsofrecovery

成分樣品中的量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%沒食子酸0.91201.122.022398.9498.360.800.92601.122.030798.350.90351.122.016399.200.91901.122.028598.860.90431.121.999897.290.91141.122.008997.53紅景天苷0.10420.130.233198.8497.601.010.10550.130.233397.910.10530.130.232297.050.10570.130.234198.490.10780.130.234697.030.10990.130.235896.27綠原酸0.10850.120.227899.3598.171.230.10770.120.224597.030.10560.120.222697.160.10620.120.223197.080.10490.120.223798.860.10890.120.228499.54咖啡酸0.04370.050.092396.8097.341.710.04490.050.093095.770.04510.050.093897.120.04620.050.094295.670.04480.050.094398.880.04310.050.093099.77

2.2正交實驗設計按照處方量稱取處方藥材，共9份，依次按照正交實驗表法進行水煎提取，合并濾液，濃縮，移至蒸發皿，置于烘箱中，60 ℃烘干至恒定質量[8]。精密稱取浸膏適量，置于錐形瓶中，依法測定沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸含量，計算浸膏得率。以干浸膏得率和沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸含量的綜合評分為指標[9]，以提取時間、液料比和提取次數為考察因素，因素水平、實驗結果和方差分析見表3～5。

表3健腎Ⅰ號膠囊的提取工藝正交實驗因素水平

Tab.3TheextractionprocessfactorandlevelofJianshenCapsulesⅠ

水平因素A,提取時間/hB,液料比/倍C,提取次數/次1161228233103

表4正交實驗結果

Tab.4Resultsoftheorthogonaltests

編號ABCD(空白)沒食子酸量/mg·g-1紅景天苷量/mg·g-1綠原酸量/mg·g-1咖啡酸量/mg·g-1干浸膏得率/%綜合評分111110.3810.0311.3890.21514.4116.725212227.2490.3990.9410.13420.2532.896313336.3970.4480.6580.09223.6928.949421238.9680.4412.5810.22721.2950.436522316.9540.4613.2090.10326.2746.613623127.8210.9201.1530.11916.2744.788731329.1621.0341.0840.43624.3959.191832137.1050.2291.0660.48315.6941.003933219.4480.5261.5190.29622.9648.579K126.19042.11734.17237.306K247.27940.17143.97045.625K349.59140.77244.91840.129R23.4011.94610.7468.319

注：綜合評分=沒食子酸量/9.448×20+紅景天苷量/1.034×15+綠原酸量/3.209×20+咖啡酸量/0.443×15+干浸膏得率/26.27×30

表5方差分析結果

Tab.5Resultsofanalysisofvariance

方差來源SSfFF臨界值PA997.6982167.37119.000<0.05B5.96121.00019.000>0.05C212.374235.62719.000<0.05D(誤差)5.9602

由表4～5可知,各因素對提取工藝的影響順序為A>C>B；因素A和C具有顯著性影響，因素B不具有顯著性影響。結合實際應用與配制，將水煎提取最佳工藝確定為A3B1C3，即加6倍量水，水煎提取3次，每次3h。

2.3驗證實驗稱取處方藥材，共3份，按照最佳工藝進行提取，結果測得干浸膏得率分別為23.90%，24.35%和24.41%；沒食子酸的含量分別為9.260，9.170和9.095mg·g-1；紅景天苷的含量分別為1.031，1.043和1.052mg·g-1；綠原酸的含量分別為1.082，1.079和1.057mg·g-1；咖啡酸的含量分別為0.433，0.446和0.439mg·g-1。結果表明，該提取工藝穩定可行。

3　討論

健腎Ⅰ號膠囊組方是蘭州大學第二醫院在醫藥辨證施治原則的基礎上，結合臨床用藥經驗以及現代藥理學研究成果化裁而來。為了保持中藥湯劑的特點，發揮中藥復方功效及其整體調理作用，結合實際中藥湯劑用藥情況，選取水煎提取法。健腎Ⅰ號膠囊，由忍冬藤、地榆、紅景天、龍葵和烏藥等8味中藥組成。其中，忍冬藤為君藥，其有效成分綠原酸和咖啡酸具有抗炎[10-11]、抗菌活性[12-14]，具有清熱解毒、通風通絡功能[15]；地榆、紅景天為方中臣藥，其中地榆的有效成分為沒食子酸，具有涼血止血的功效[15]；紅景天的有效成分為紅景天苷，具有益氣活血、抗炎和增強免疫力[16-18]等作用；4種成分相輔相成發揮健腎功效。因此，選擇沒食子酸、綠原酸、咖啡酸和紅景天苷作為篩選健腎Ⅰ號膠囊水煎提取工藝的主要指標，通過正交實驗，優選健腎Ⅰ號膠囊水煎提取最佳工藝。結果顯示，優選的健腎Ⅰ號膠囊水煎提取工藝穩定，合理可行，為配制該制劑提供了理論依據，可用于健腎Ⅰ號膠囊的實際配制。

沒食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸均為水溶性成分，采用水煎提取工藝，既符合中藥湯劑的特點，又能將藥材的有效成分提取得比較完全，避免了使用其他有機溶媒可能帶入的污染及毒性。符合醫院制劑實際配制情況，便于患者使用和接受。綜上所述，優選的健腎Ⅰ號膠囊水煎提取工藝穩定，合理可行，為配制該制劑提供了理論依據，可用于健腎Ⅰ號膠囊的實際配制。

[1]周小雅，梁光毅，劉雪梅．高效液相色譜法測定草龍中沒食子酸的含量[J]．西北藥學雜志，2014，29(3)：235-237．

[2]王曙東，蘇華，陳翠，等．HPLC法測定益利康軟膠囊中紅景天苷的含量[J]．中國藥師，2012，15(8)：1140-1142．

[3]陳曉鵬，鄂秀輝，夏忠庭，等．HPLC法同時定量測定養血清腦顆粒中7個主要成分[J]．中成藥，2013，35(9)：1921-1924．

[4]樊寶娟，劉雪峰，曾愛國，等．HPLC法測定金線草不同部位沒食子酸的含量[J]．西北藥學雜志，2014，29(6)：573-575．

[5]鄒盛勤，陳武．地榆中烏索酸和齊墩果酸含量的高效液相色譜測定[J]．時珍國醫國藥，2006，17(8)：1373-1374．

[6]楊靜，萬峰峰，蔡慧俠，等．血復生膠囊質量標準研究[J]．陜西中醫，2013，34(2)：234-236．

[7]郭靜，周春玲．口腔炎噴霧劑的質量標準研究[J]．中國藥師，2013，16(3)：376-378．

[8]鄧中銀，伍振峰，艾志福，等．復方胃舒膠囊提取工藝優選及質量標準[J]．中國實驗方劑學雜志，2013，19(9)：33-37．

[9]李軍民，王娟弟，秦龍，等．正交實驗法優選肝炎康膠囊的水煎提取制備工藝[J]．中國藥師，2014，17(10)：1662-1665．

[10]楊斌，丘岳，王柳萍，等．廣西山銀花綠原酸體外抗炎作用及分子機制研究[J].中國藥理學通報，2009，25(4)：542-545．

[11]宋亞玲，王紅梅，倪付勇，等．金銀花中酚酸類成分及其抗炎活性研究[J]．中草藥，2015，46(4)：490-495．

[12]TsouMF，HungCF，LuHF，etal.Effectsofcaffeicacid,chloronenicacidandferulicacidongrowthandarylamineN-acetvltransferaseactivityinShigellasonnei(groupD)[J].Microbios，2000，101(398):37-46．

[13]林學政，柳春燕，陳靠山，等．不同地域牛蒡葉綠原酸的含量比較及其抑菌實驗[J]．天然產物研究與開發，2004，16(4)：328-330．

[14]DoqasakiC，ShindoT，FuruhataK，etal.IdentificationofchemicalstructureofantibacterialcomponentsagainstLegionellapneumophilainacoffeebeverage[J].YakuqakuZasshi，2002，122(7)：487-494.

[15]國家藥典委員會．中國藥典2010年版[S]．一部．北京：中國醫藥科技出版社，2010,117,179.

[16]龔舒，甘淋．紅景天苷藥理作用的分子機制研究進展[J]．現代醫藥衛生，2015，31(5)：696-699．

[17]丁奇，曹兵，劉熙鵬．紅景天對神經系統藥理作用的研究進展[J]．中國臨床醫生，2014，42(7)：23-25．

[18]張明發，沈雅琴．紅景天苷及其苷元酪醇的抗炎、抗腫瘤和免疫調節作用[J]．藥物評價研究，2013，36(3)：228-234．

Optimization of water extraction procedure for Jianshen CapsulesⅠwith orthogonal experimental design

CHEN Mengyu1,2，NIU Qianqian1，JIAO Haisheng2*

(1.College of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.Department of Pharmacy，the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China)

Objective To optimize the water decocting extraction procedure for Jianshen CapsulesⅠ.Method With the comprehensive score of the yield of dry extract，gallic acid，salidroside， chlorogenic acid，and caffeic acid as index，L934orthogonal experimental design was carried out to optimize the extraction process by taking the extraction time， liquid-solid ratio and extraction times as factors. Results The influencing order of the factors was A>C>B(A: extracting time，B: liquid-solid ratio，C: extracting times). The optimal extraction conditions were A3B1C3.The optimal extraction process was as follows: the ratio of liquid-solid was 6，the extraction times were 3，the extraction time was 3 h.Conclusion This optimal water decocting extraction procedure was stable and feasible. It can be used in the real preparation for Jianshen Capsules Ⅰ.

Jianshen CapsulesⅠ；orthogonal design test；water decocting extraction

陳夢鈺，女，在讀碩士研究生

焦海勝，男，教授，碩士研究生導師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.004

R284

A

1004-2407(2016)05-0451-05

2015-11-23)