HPLC法同時測定大鼠血漿中川芎成分洋川芎內酯 Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸

姜　維，趙　美，陳　曦，郭　舜，劉新友

(第四軍醫大學唐都醫院藥劑科，西安　710038)

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·藥物分析·

HPLC法同時測定大鼠血漿中川芎成分洋川芎內酯 Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸

姜維，趙美，陳曦，郭舜，劉新友*

(第四軍醫大學唐都醫院藥劑科，西安710038)

目的建立以HPLC法同時測定大鼠血漿中洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸質量濃度的方法。方法含藥血漿進行3種提取方法對比。色譜條件為：Agilent5TC-C18(2)(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫為室溫(25 ℃)；流動相為甲醇-2mL·L-1甲酸水梯度洗脫；流速為0.6mL·min-1；檢測波長為280nm。結果以乙酸乙酯和正己烷為萃取溶劑的血樣處理方法效果最佳；洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸質量濃度分別在2.5～250，2.0～200和1.25～125μg·mL-1范圍內線性良好。平均回收率均大于85%，日內和日間RSD值均小于4%。結論該方法的血漿萃取效果較理想，檢測方法簡便、快速、靈敏、可靠，可應用于血漿中川芎主要成分的血藥質量濃度分析。

洋川芎內酯Ⅰ；藁本內酯；阿魏酸；血藥質量濃度；高效液相色譜法

川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort的干燥根莖，具有祛風濕、止痛、活血祛瘀功能，主治血瘀氣滯的月經不調、閉經、痛經及產后瘀滯腹痛等，也是治療頭痛的要藥[1-2]。隨著LC/MS、GC/MS等色譜-質譜聯用技術的應用，川芎體內成分的檢測取得了很大突破[3-6]，對川芎入血成分的研究主要集中在洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸等酚酸類和苯酞類成分[7-11]。由于洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸不僅極性和溶解性差異非常大，而且阿魏酸易異構或分解[12]，導致3種物質的吸收入血后的血樣制備方法和HPLC分析方法出現很大差異，通常需要不同的樣品制備方法和色譜條件，同一份血漿樣本需要分多次檢測不同成分，這樣重復繁瑣的檢測方法不利于藥代動力學的研究。本實驗從含藥血漿HPLC的分析方法入手，研究同時檢測川芎提取物中3種主要入血成分洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的方法。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);SartoriusBP221S型萬分之一天平(德國Sartorius公司)；SK-1型快速混勻器(常州澳華儀器有限公司)；超純水制水機；TGL-20M高速臺式低溫冷凍離心機(湘儀公司)。

1.2試藥阿魏酸對照品、藁本內酯對照品(中國藥品生物制品檢定研究院，批號分別為110773-201313和110773-201507，質量分數≥99%)；洋川芎內酯Ⅰ對照品(北京嘉世玉禾化工技術研究院，批號為Y-085-151009，HPLC法測質量分數≥98%)；川芎藥材，市售，經鑒定，為傘形植物川芎(Ligusticum chuanxiongHort)的干燥根莖；色譜純：甲醇(美國Fisher公司)；超純蒸餾水(自制)；甲酸、乙酸乙酯、正己烷和其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2) (250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相A為甲醇，B為2 mL·L-1甲酸水。梯度洗脫(0～9 min，50% A；9～15 min，50%～60% A;15～25 min，60%～75% A)。檢測波長：280 nm;流速：0.6 mL·min-1;柱溫：室溫(25 ℃);進樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1藥材提取液稱取川芎藥材粗粉100g，加入800mL體積分數為75%的乙醇，回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，減壓濃縮至100mL，備用。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取洋川芎內酯Ⅰ 5.0mg、藁本內酯4.0mg和阿魏酸2.5mg，分別置于10.0mL棕色量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別制備成洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸對照品溶液，質量濃度分別為500.0,400.0和250.0μg·mL-1。取洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸適量，混勻，用不同量的甲醇稀釋至不同質量濃度，制備系列混合對照品溶液。

2.2.3空白血漿加供試品溶液的制備正常SD大鼠取血前禁食12h，自由飲水。眼底叢靜脈取血，置于肝素鈉采血管內，以8 000r·min-1離心10min，分離上層血漿。取200μL空白血漿+40μL藥材提取液，漩渦1min，樣品中加入冰乙酸甲醇液50μL，漩渦1min，加入乙酸乙酯正己烷1 000μL，漩渦2min，以8 000r·min-1離心10min，重復萃取2次，取全部上層上清液減壓抽干，用200μL甲醇復溶，0.22μm膜過濾，備用。

2.2.4空白血漿加對照品供試品溶液的制備正常SD大鼠取血前禁食12h，自由飲水。眼底叢靜脈取血1mL，置于肝素鈉采血管內，以8 000r·min-1離心10min，取上清液0.2mL，加入20μL洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸混合對照品溶液，按照2.2.3項下空白血漿供試品溶液制備方法制備樣品。按照此方法制得一系列質量濃度的空白血漿加混合對照品的供試品溶液，以及空白血漿加單獨對照品的供試品溶液。

2.3方法學考察

2.3.1方法專屬性考察及檢出限通過對比空白大鼠血漿以及空白血漿加洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸混合對照品的液相色譜圖，各液相色譜圖見圖1，可見該方法對藥材成分的檢測并無明顯干擾，說明該液相條件具有良好的方法專屬性。以信噪比為3∶1時各指標成分的濃度作為其檢出限，可得洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的檢出限分別為1.25，0.50和0.70μg·mL-1。用該色譜方法分析空白血漿加供試品溶液和空白血漿加混合對照品的供試品溶液，見圖1。由圖1可知，該方法在供試品的血漿檢測中也無干擾。

圖1HPLC圖

a.空白血漿；b.混合對照品；c.樣品；1.阿魏酸；2.洋川芎內酯Ⅰ；3.藁本內酯

Fig.1HPLCchromatograms

a.blankplasma;b.plasmaspikedwithfumalicacid，senkyunolideⅠandligustilide；c.plasmasampleafterLigusticum wallichiiadministrated；1.fumalicacid；2.senkyunolideⅠ；3.ligustilide

2.3.2線性范圍精密吸取血漿200μL，加入20μL系列質量濃度的洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸混合對照品溶液，制得系列質量濃度供試品溶液。按擬定樣品處理方法制備樣品，在擬定色譜條件下進樣20.0μL，記錄峰面積。以對照品質量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標，以對照品積分面積為縱坐標(Y，A)，進行回歸分析，得回歸方程及線性范圍，見表1。表1空白血漿加對照品溶液線性關系實驗結果

Tab.1ThelinearcorrelationresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

對照品名稱回歸方程r線性范圍/μg·mL-1洋川芎內酯ⅠY=27.604X-0.39850.99912.5～250藁本內酯Y=41.287X+19.1370.99962.0～200阿魏酸Y=62.414X-9.63990.99931.25～125

2.3.3精密度實驗按照擬定方法制備低、中、高3個質量濃度的空白血漿加對照品溶液，在擬定分析條件下，進樣 20.0μL分析。在1d內重復測定6次，求得日內偏差，結果見表2。將上述3個質量濃度的樣品分別在6d內連續測定6次，求得日間偏差，結果見表2。結果表明,儀器精密度良好。

按照2.2.3項下空白血漿供試品溶液制備方法制備樣品，在擬定分析條件下，進樣 20.0μL分析。在1d內重復測定6次，統計樣品中洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸色譜峰積分面積求得日內偏差，結果洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的日內精密度RSD值分別為2.95%,1.36%和1.59%;樣品分別在6d內連續測定6次，求得日間偏差，結果洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的日間精密度RSD分別為2.78%,1.57%和3.42%,結果表明儀器精密度良好。

2.3.4重復性實驗精密量取200.0μL空白血漿18份，平行分為3組，分別加入20.0μL低、中、高質量濃度的混合對照品溶液，按照擬定處理方法制備樣品，在擬定色譜條件下進樣分析，其重復性實驗RSD值見表2，結果表明，色譜條件重復性良好。

2.3.5穩定性實驗取空白血漿樣品，加入不同質量濃度的洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸混合對照品溶液，得到低、中、高3個質量濃度的空白血漿加對照品溶液，室溫下放置4，6，8，10，12和24h，按照擬定樣品制備方法制備樣品。在擬定條件下進樣 20.0μL分析，通過測定洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的質量濃度變化，考察溫度對樣品穩定性的影響，實驗結果見表3，結果表明穩定性良好。

表2洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸精密度考察結果

Tab.2TheprecisionresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

對照品質量濃度/μg·mL-1日內精密度RSD/%日間精密度RSD/%重復性RSD/%洋川芎內酯Ⅰ12.53.224.623.5050.02.652.171.60250.01.481.561.86藁本內酯10.03.271.673.2940.01.250.992.04200.01.202.431.50阿魏酸6.251.292.292.6125.02.594.263.97125.00.893.861.66

表3洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的穩定性

Tab.3ThestabilityresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

對照品質量濃度/μg·mL-1測得量/×10-3μg4h6h8h10h12h24h平均值/×10-3μgx±sRSD/%洋川芎內酯Ⅰ12.5011.6111.2211.5312.1311.4312.3311.7±0.433.6750.0047.5947.5347.0748.1549.7548.1748.04±0.931.94250.00234.07236.85237.17235.28239.27238.64236.88±1.970.83藁本內酯10.009.979.809.239.729.149.529.06±0.303.9040.0039.1738.9440.1739.6239.2138.8539.32±0.491.27200.00193.97194.58196.85190.03194.81192.4193.77±2.331.71阿魏酸6.256.246.406.426.706.636.656.51±0.182.8625.0023.9923.6323.2524.0922.6922.7523.40±0.613.47125.00119.30117.83114.34117.63113.53113.93113.43±1.013.60

2.3.6提取回收率將20μL的對照品溶液分別加入到200μL的空白血漿和甲醇中，制成低、中、高3個質量濃度的洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸空白血漿樣品和洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸甲醇溶液。按照2.2.3項下血漿處理方法制備樣品，記錄峰面積，以公式Rt=(AX/Ac)×100%計算方法回收率。式中：Rt為提取回收率，AX為血漿指標成分實測峰面積，Ac為甲醇溶液指標成分峰面積。以血漿中洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸與甲醇溶液中洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的峰面積之比計算提取回收率。結果見表4和表5。

2.3.7方法回收率按照擬定方法制備低、中、高3個質量濃度的空白血漿加對照品溶液，在擬定分析條件下，進樣20.0μL。記錄峰面積，由洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸線性方程計算得到，由公式R=(AX/AS)×100%計算方法回收率，實驗測定數據見表5。式中：R為方法回收率；AX為血漿成分實測峰面積；AS為按標準曲線計算的指標成分峰面積。

2.4結果由考察結果可知，該方法洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的檢出限分別為1.25，0.50和0.70μg·mL-1。線性范圍分別為2.5～250，2.0～200和1.25～125μg·mL-1，線性范圍內3種指標成分線性關系良好；高、中、低3個質量濃度提取回收率和方法回收率均大于80%；精密度、重復性和穩定性實驗RSD值均小于10%。由以上數據可知，回收率、精密度、重復性和穩定性等指標均適合生物樣品測定要求，表明該方法可用于大鼠血漿中洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的分析。

表4洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸提取回收率

Tab.4TheextractionrecoveryrateresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

對照品名稱加入量/μg·mL-1血樣中測得量/μg·mL-1甲醇中測得量/μg·mL-1平均回收率/%RSD/%洋川芎內酯Ⅰ12.511.57±0.6713.38±0.6586.474.7150.048.57±2.2553.71±2.3190.434.02250.0235.96±1.27266.58±5.4288.513.68藁本內酯10.09.01±0.3610.61±0.5184.923.8440.038.49±0.7142.15±0.5791.321.76200.0194.92±3.14209.82±3.4992.901.45阿魏酸6.256.10±0.126.69±0.1891.182.5125.023.64±1.3425.54±0.4592.563.99125.0115.32±0.99129.08±1.1989.341.85

表5洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸方法回收率

Tab.5ThemethodrecoveryresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

對照品加入量/×10-3μg測得量/×10-3μg平均回收率/%RSD/%洋川芎內酯Ⅰ12.511.55±0.8492.403.2150.048.53±0.9397.082.28250.0234.49±3.5593.791.55藁本內酯10.09.38±0.4093.814.2940.039.06±0.4997.661.24200.0195.16±2.8697.581.46阿魏酸6.256.01±0.1296.162.0025.024.07±0.6696.282.75125.0115.90±1.9592.721.68

3　結論

本實驗在保證洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸3個指標成分良好的分離度的同時，對樣品處理方法和色譜條件進行了系統優化，考察3個樣品制備方法制備樣品：

方法一：200μL空白血漿+40μL藥材提取液，漩渦1min，加入甲醇1 000μL沉淀蛋白，漩渦2min，以8 000r·min-1離心10min，取出上層上清液后，取全部上層上清液減壓抽干，用200μL甲醇復溶，0.22μm膜過濾，備用。

方法二：200μL空白血漿+40μL藥材提取液，漩渦1min，加入乙酸乙酯-正己烷萃取液1 000μL，漩渦2min，以8 000r·min-1離心10min，取出上層上清液后，原液重復萃取2次，取全部上層上清液減壓抽干，用200μL甲醇復溶，0.22μm膜過濾，備用。

方法三：200μL空白血漿+40μL藥材提取液，漩渦1min，樣品中加入冰乙酸甲醇液50μL，漩渦1min，加入乙酸乙酯正己烷1 000μL，漩渦2min，以8 000r·min-1離心10min，重復萃取2次，取全部上層上清液減壓抽干，用200μL甲醇復溶，0.22μm膜過濾，備用。

在擬定分析條件下，進樣10.0μL，對比提取效果，由液相色譜圖可知，在阿魏酸出峰處差異最顯著，其中方法三即本實驗選定方案。

其中改進最顯著的為對阿魏酸的提取和穩定。阿魏酸在醇溶液中容易異構或分解，在混合萃取劑中也有部分分解，使得液相色譜出現雙峰或者肩峰，極大地干擾了積分面積的計算。本實驗將提取方法加酸優化后，使用了乙酸乙酯和正己烷的混合萃取劑，使得樣品處理方法具有回收率高、靈敏度高、重復性及穩定性良好、且操作簡便的特點；液相色譜條件及樣品分析時間較短，3種指標性成分均達到良好的分離。表明該方法適合于大鼠血漿中洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯和阿魏酸的含量測定，從而為川芎作用物質基礎的研究提供了一種耗時較短、靈敏可靠的樣本處理方法和分析手段。

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Simultaneous determination of senkyunolide Ⅰ，ligustilide and fumalic acid of Ligusticum chuanxiong Hort in rats plasma by HPLC

JIANGWei，ZHAOMei，CHENXi，GUOShun，LIUXinyou*

(Department of Pharmacy，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710038，China)

ObjectiveToestablishanHPLCmethodforthesimultaneousdeterminationoftheconcentrationofsenkyunolideⅠ，ligustilideandfumalicacidinratsplasma.MethodsThreesamplepreparationmethodswerecompared；chromatographicseparationwasaccomplishedusingAgilent5TC-C18(2)(250mm×4.6mm，5μm).Thecolumntemperaturewasatroomtemperature(25 ℃).Themobilephasewascomposedofmethanoland2mL·L-1formicacidinwaterinagradientelutionmode.Theflowratewassetat0.6mL·min-1.Thedetectionwavelengthwassetat280nm.ResultsThesamplepreparationmethodusingethylacetateandn-hexaneforbloodsamplesproducedbetterchromatographicbehavioroftheanalytes.ThegoodlinearrangesofsenkyunolideⅠ，ligustilideandfumalicacidwere2.5-250，2.0-200and1.25-125μg·mL-1，respectively.TheaveragerecoveryratesofsenkyunolideⅠ，ligustilideandfumalicacidinthismethodwasmorethan85%；andboththeintradayRSDandtheinterdayRSDwerelessthan4%.ConclusionsThesamplepreparationmethodshowedbettereffectandtheanalyticalmethodforbloodsamplesissimple，rapid，sensitive，reliable，andcanbeemployedforthesimultaneousdeterminationofmajorcomponentsofLigusticum wallichiiinratsplasma.

senkyunolideⅠ；ligustulide；fumalicacid；plasmaconcentration；HPLC

陜西省中醫藥管理局資助項目(編號：13-ZY039)

姜維，男，藥師，碩士研究生

劉新友，男，副主任藥師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.007

R945

A

1004-2407(2016)05-0462-05

2015-10-25)