阿托伐他汀鈣片有關物質的HPLC分析法

于妮娜，張　玲，孟淑華

(1.陜西省新藥審評中心，西安　710065；2.西安天一秦昆制藥有限責任公司，西安　710077)

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阿托伐他汀鈣片有關物質的HPLC分析法

于妮娜1，張玲2，孟淑華2

(1.陜西省新藥審評中心，西安710065；2.西安天一秦昆制藥有限責任公司，西安710077)

目的 建立阿托伐他汀鈣片有關物質的測定方法。方法采用反相HPLC法，測定阿托伐他汀鈣片有關物質的含量。采用SyncronisC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相A為醋酸緩沖液∶乙腈∶四氫呋喃(61∶27∶12)，流動相B為醋酸緩沖液∶乙腈∶四氫呋喃(47∶41∶12)；流速為1.5mL·min-1；檢測波長為260nm；柱溫為35 ℃。結果阿托伐他汀鈣雜質1、雜質2、雜質3、雜質4、雜質6與阿托伐他汀峰均可達到基線分離；檢測限分別為阿托伐他汀2ng，雜質1 2ng、雜質2 2ng、雜質3 2ng、雜質4 2ng、雜質6 1.6ng，且重復性良好，總雜質RSD值為1.87%(n=6)。結論該方法穩定、可靠、專屬性強，可用于阿托伐他汀鈣片的有關物質檢測。

阿托伐他汀鈣；有關物質；雜質測定；高效液相色譜法

阿托伐他汀鈣(C33H34FN2O5)2Ca·3H2O是選擇性、競爭性3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，可顯著降低膽固醇水平，降低心肌梗死和腦卒中的發病危險，對原發性高膽固醇血癥，包括家族性高膽固醇血癥、混合型高膽固醇血癥以及純合子家族性高膽固醇血癥患者具有顯著的療效。對于阿托伐他汀鈣片有關物質的研究也有文獻報道[1-4]，而國家標準[5-6]僅控制單個雜質和總雜質，對于雜質的研究并不充分，不能有效地控制。本實驗結合USP、CP和EP等[7-8]對阿托伐他汀鈣片有關物質的檢測方法進行研究，采用對照品外標法對已知雜質進行定性、定量測定，其他未知雜質采用主成分自身對照法定量。本實驗所建立方法可使阿托伐他汀鈣、5個已知雜質及未知雜質達到基線分離，且方法簡便易行、結果準確。

1　儀器與試藥

1.1儀器U3000型高效液相色譜儀(美國戴安ThermoSeparationProducts公司)；BS110S型分析天平，CP225D型分析天平(德國賽多利斯公司)；色譜柱：SyncronisC18(250mm×4.6mm，Thermo公司)；C18柱(250mm×4.6mm，粒徑5μm，江蘇漢邦公司)；XB-C18柱(250mm×4.6mm，粒徑5μm，Welchmaterials公司)。

1.2試藥色譜純：乙腈，四氫呋喃(TEDIA公司)；冰醋酸(江蘇漢邦公司)。分析純：檸檬酸，氨水(天津市登峰化學試劑廠)；醋酸銨(鄭州派尼化學試劑廠)。水為超純水。

2　方法與結果

2.1色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。流動相A:醋酸緩沖液(取醋酸銨3.9g，加水1 000mL，用冰醋酸調節pH值為5.0～5.1)∶乙腈∶四氫呋喃(61∶27∶12)；流動相B:醋酸緩沖液∶乙腈∶四氫呋喃(47∶41∶12)；按照下列程序梯度洗脫[9],見表1，進樣前平衡10min。流速：1.5mL·min-1；檢測波長：260nm；柱溫：35 ℃。

2.2系統適用性實驗取阿托伐他汀鈣及阿托伐他汀雜質2對照品適量，加混合溶劑[以0.05mol·L-1的檸檬酸銨溶液(0.05mol·L-1檸檬酸用氨水調節pH值至7.4)-乙腈(50∶50)]制成質量濃度為50μg·mL-1的溶液，取20μL注入液相色譜儀，理論板數以阿托伐他汀計應不低于5 000，分離度應符合要求。見圖1。

表1梯度洗脫順序

Tab.1Thegradientelutionprogram

時間/min流動相A/%流動相B/%01000401000650100850100

圖1系統適用性色譜圖

1.雜質2；2.阿托伐他汀鈣

Fig.1Systemsuitabilitychromatograms

1.impurity2；2.atorvastatincalcium

2.3專屬性為了考證色譜系統是否適用于本品各種降解產物的分離，采用酸、堿、光照、氧化和加熱方法對樣品溶液進行破壞實驗，使其產生降解產物的峰，在HPLC條件下檢測雜質峰與主峰分離的情況。(1)酸破壞實驗：取本品細粉0.15g，置于20mL量瓶中，加入混合溶劑10mL使其溶解，再加入1mol·L-1的鹽酸溶液1.0mL，放置24h，用1mol·L-1的氫氧化鈉溶液調至中性；(2)堿破壞實驗：取本品細粉0.15g，置于20mL量瓶中，加入混合溶劑10mL溶解，再加入1.0mL1mol·L-1的氫氧化鈉溶液，放置24h，用1mol·L-1的鹽酸溶液調至中性；(3)氧化破壞：取本品細粉0.15g，置于20mL量瓶中，加入混合溶劑10mL溶解，再加入0.1mL的雙氧水(濃度為30mL·L-1)，放置12h，加溶劑定容至刻度；(4)光破壞實驗：取本品細粉0.15g，置于20mL量瓶中，加入溶劑溶解并定容至刻度，在4 500±500lx的光照箱中放置24h；(5)熱破壞實驗：取本品細粉0.15g，置于20mL量瓶中，加溶劑溶解并定容至刻度，置于干燥箱中70 ℃放置24h，取出，放至室溫。取上述破壞實驗溶液，按照2.1 項下條件進行檢測，色譜見圖2～3。結果顯示，主成分峰與酸、堿、光、熱和氧化破壞產生的降解物均可達到有效分離，說明該色譜條件可有效分離雜質，且輔料對測定不產生干擾[10]。

圖2 破壞性實驗色譜圖

a.供試品；b.光照破壞；c.高溫破壞；d.堿破壞；e.酸破壞；f.氧化破壞

Fig.2Destructivetestchromatograms

a.testsampleb.destroyedbylight；c.destroyedbyheat；d.destroyedbyalkali；e.destroyedbyacid；f.destroyedbyoxidative

2.4線性及范圍分別取阿托伐他汀鈣對照品及阿托伐他汀鈣雜質1，2，3，4和6對照品適量，按照對照品溶液的制備方法配制成1mL約含阿托伐他汀及阿托伐他汀鈣雜質(1，2，3，4 和6) 0.3，0.6，1.2，1.8，2.4和3.0μg的混合溶液(阿托伐他汀鈣雜質1，2和3以游離形式即去氟阿托伐他汀、反式阿托伐他汀和雙氟阿托伐他汀計算)，分別精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積積分值。以質量濃度為橫坐標(X)，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，對測定結果進行回歸分析，雜質1，2，3，4和6的回歸方程如下：Y=0.411 2 X-0.001 1，r=0.999 8；Y=0.383 4 X+0.002 8，r=0.999 8；Y=0.390 2 X-0.005 6，r=0.999 8；Y=0.313 7 X-0.008 8，r=0.999 8；Y=0.405 X+0.004 6，r=0.999 8。

結果表明，阿托伐他汀鈣雜質1、雜質2、雜質3、雜質4和雜質6的進樣量分別在6.182～74.184ng，5.802～69.624ng，6.196～74.352ng，6.0～72.0ng和6.4～64.0ng之間時，各雜質的進樣量與峰面積積分值之間呈良好的線性關系。

圖3HPLC圖

A.空白；B.混合對照品；C.供試品；1.雜質1；2.雜質2；3.阿托伐他汀鈣；4.雜質3；5.雜質4；6.雜質6

Fig.3HPLCchromatograms

A.blank；B.mixedreferencesubstance；C.testsamples；1.impurity1；2.impurity2；3.atorvastatincalcium；4.impurity3；5.impurity4；6.impurity6

2.5檢測限精密量取混合阿托伐他汀及各雜質的混合對照品，用混合溶劑乙腈-水(50∶50)逐步稀釋至各主峰的響應值約為噪音水平的3倍時，記錄色譜圖，得出各檢測限分別約為：阿托伐他汀2ng，雜質1 2ng、雜質2 2ng、雜質3 2ng、雜質4 2ng、雜質6 1.6ng。

2.6重復性實驗按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，吸取20μL，在上述色譜條件下進行測定，記錄色譜圖和數據。實驗結果表明，除總雜質的RSD值為1.87%，其他已知單個雜質測定結果無差異，重復性良好，誤差在允許的范圍內。

2.7溶液穩定性取供試品溶液和自身對照溶液，分別在0，4，8，26和30h取樣20μL，注入液相色譜儀(暗處放置)，記錄色譜圖及峰面積積分值，結果表明，樣品溶液中主成分及雜質峰面積在8h內穩定，有關物質個數及量不變，8h后雜質4和雜質6及氧化主雜質變化顯著，因此本品有關物質測定供試品溶液應現制，放置不得超過8h。

2.8樣品測定按照建立的方法測定10批樣品，結果見表2。

表210批樣品有關物質測定結果(外標法測定)

Tab.2 10batchesofsamplesrelatedsubstancesdeterminationresults(externalstandardmethod)

批號有關物質/%雜質1雜質2雜質3雜質4雜質6(主峰)1011010.110.100.040.440.201011020.120.120.040.210.161011030.120.090.040.290.181012010.120.130.060.130.091012020.150.140.050.200.161012030.120.130.040.230.131012040.140.090.030.260.131101010.130.090.030.080.081101020.110.090.020.100.101101030.110.080.050.050.03

3　討論

3.1流動相的選擇與分析原料標準[YBH00262010]有關物質梯度洗脫,隨著四氫呋喃增加基線逐漸明顯向上漂移嚴重，采用扣除基線的方法測定，但色譜峰仍難以辨識且積分不準確，四氫呋喃用量較大、價格昂貴、氣味毒性較大。標準[H20030118]方法阿托伐他汀雜質在前40 min分離較好，各個雜質基本達到基線分離，但在75 min后雜質仍不能完全洗脫出柱。歐洲藥典和美國藥典方法阿托伐他汀雜質在70 min分離較好，各個雜質基本達到基線分離，75 min雜質基本洗脫出柱，但70 min以后基線不平，仍有饅頭峰出現。經參考歐洲藥典和美國藥典方法調整流動相，A相微調，保證阿托伐他汀保留時間在27～34 min之間，運行40 min；調整B相乙腈的比例及梯度時間，確定最終流動相。在調節流動相的過程中，增加乙腈比例和pH值，可使阿托伐他汀保留時間縮短，反之亦然。

在此色譜條件下，阿托伐他汀保留時間在27～34min之間，已知阿托伐他汀鈣雜質1，2，3，4和6均能達到基線分離，雜質2與阿托伐他汀分離度≥1.5，其他雜質峰也基本能達到基線分離，雜質在80min能完全被洗脫出柱，基線平穩，繼續洗脫至120min無雜質峰出現。

3.2檢測波長的選擇將阿托伐他汀鈣及阿托伐他汀雜質1，2，3，4和6對照品溶液及空白輔料溶液在200～400nm處進行掃描，結果顯示，在244和260nm處各溶液所出峰的個數相同，各個峰在260nm下的峰面積約為244nm下的80%～90%。260nm下梯度運行基線比244nm下平穩，更利于色譜峰的積分和判斷。

3.3色譜柱及pH值的影響本品有關物質多，因此對色譜柱的要求較高，在已對比使用的色譜柱中以Thermo公司的SyncronisC18(250mm×4.6mm)，(填料參數：碳載量16%，粒徑5μm，孔徑100A，比表面積320m2·g-1，USP分類為L1)分離效果最好。本色譜系統乙腈和pH值對主峰的保留時間影響較大，增加乙腈和升高pH值均會使主峰保留時間縮短，反之亦然。實驗以精密pH值計調節pH值在5.0±0.1范圍內，必要時調節乙腈比例使阿托伐他汀保留時間在26～34min之間，相對保留時間變化不明顯。

[1]張亞平，楊淑蓮，陳芬兒.HPLC法檢測阿托伐他汀鈣有關物質的含量及光學純度[J].藥物分析雜志，2010，30(12)：2311-2313.

[2]李文莉，鐘慶元，文慶.HPLC法測定阿托伐他汀鈣膠囊的含量及有關物質[J].藥物分析雜志，2007，27(2):267-269.

[3]王艷麗，于曉原，張璐璐，等.阿托伐他汀鈣治療老年冠心病合并高脂血癥的療效觀察[J].西北藥學雜志，2013，28(6):630-631.

[4]汪欽標，楊成鈺.HPLC法測定阿托伐他汀鈉含量及有關物質[J].輕工科技，2012，(3)：124-125.

[5]蔣廈，沈衛陽.RP-HPLC法測定阿托伐他汀鈣片的有關物質[J].海峽藥學，2013，25(8):60-62.

[6]WS1-(X-106)-2003Z，國家食品藥品監督管理局標準[S].

[7]YBH00262010，國家食品藥品監督管理局標準[S].

[8]USP34-29NF29 [S].2011：1949.

[9]EP7.1[S].2011：3380.

[10]王嫦鶴，焦艷，杜珊，等．HPLC法測定烏拉地爾不同制劑中的有關物質[J] 西北藥學雜志，2013，28(3): 254-257.

Determination of the related substances in Atorvastatin Calcium Tablets by HPLC

YU Nina1，ZHANG Ling2，MENG Shuhua2

(1.ShaanxiProvincialCenterforNewDrugEvaluation，Xi′an710065，China；2Xi′anTianyiqinkunPharmaceuticalLimitedCompany，Xi′an710077，China)

ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationoftherelatedsubstancesinAtorvastatinCalciumTablets.MethodsRP-HPLCwasadoptedtodeterminethecontentofatorvastatincalcium.ThedeterminationwasperformedonaSyncronisC18column(250mm×4.6mm，5μm)withthemobilephaseAconsisitedofacetatebuffer-acetonitrile-tetrahydrofuran(61∶27∶12)，andthemobilephaseBconsisitedofacetatebuffer-acetonitrile-tetrahydrofuran(47∶41∶12).Theflowratewas1.5mL·min-1，andthedetectivewavelengthwassetat260nm.Thecolumntemperaturewas35 ℃.ResultsTheimpurities1，2，3，4，6andatorvastatincalciumpeakswerebaselinelyseparated.Thelimitofdetectionofatorvastatinwas2ng，andthelimitsofimpurities1，2，3，4and6were2，2，2，2and1.6ng.Therepeatbilityperformedwell，andtheRSDwas1.87%(n=6).ConclusionThemethodisreliable，stable，andspecific，anditissuitableforthethedeterminationoftherelatedsubstancesinAtorvastatinCalciumTablets.

atorvastatincalcium；relatedsubstances；determinationofimpurities；HPLC

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.008

R917

A

1004-2407(2016)05-0466-04

2015-12-01)