傳統中藥中抗動脈粥樣硬化PPARα激動劑的虛擬篩選

杜　霞，張鑫磊，李　曄*

(1.陜西省中醫藥研究院中藥研究所，西安　710003；2.第四軍醫大學藥學系，西安　710032)

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·化學·

傳統中藥中抗動脈粥樣硬化PPARα激動劑的虛擬篩選

杜霞1，張鑫磊2，李曄1*

(1.陜西省中醫藥研究院中藥研究所，西安710003；2.第四軍醫大學藥學系，西安710032)

目的 基于傳統中藥尋找抗動脈粥樣硬化的先導藥物分子。方法過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是抗動脈粥樣硬化的研究熱點之一，以該受體為靶標，采用計算機輔助藥物分子設計方法中的藥效團篩選、分子對接和相互作用模式分析對傳統中藥數據庫進行虛擬篩選。結果從含有37 170個化合物的傳統中藥數據庫中優選出20個活性較好的化合物，通過進一步的氫鍵作用分析確認3個先導化合物。結論該研究為新型抗動脈粥樣硬化PPARα激動劑的發現提供了新的方法和理論依據。

動脈粥樣硬化；PPARα激動劑；藥效團篩選；分子對接

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種嚴重危害人類健康的慢性炎癥疾病[1-2]。1990年，英國科學家IssemannI等[3]發現了一種由配體調控的核激素受體——過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferators-activatedreceptors，PPARs)，這是一類由配體激活的核轉錄因子，主要包含3種亞型：α、δ和γ。近年來，大量實驗表明，PPARα經配體激活后可以通過直接作用于動脈管壁，從而抑制單核細胞向血管內皮聚集并轉化為巨噬細胞，抑制血管平滑肌細胞的增殖、遷移以及抑制泡沫細胞的形成等炎癥細胞的趨化和浸潤，是動脈粥樣硬化治療研究的熱點之一[4-9]。

目前，臨床使用的PPARα激動劑類藥物主要為貝特類藥物，如：氯貝特、苯扎貝特和環丙貝特等。該類藥物的突出作用就是可以顯著降低三酰甘油，通過糾正血脂異常來發揮抗動脈粥樣硬化作用[10-11]。然而，這類藥物與受體的結合能力較弱、選擇性較低,服用一段時間后通常需要增大服用劑量來維持療效，長期服用還可引起肝腎功能損害以及藥物性橫紋肌溶解癥等不良反應[12-13]。因此，從傳統中藥出發，尋找更加安全有效的天然高選擇性PPARα激動劑類藥物成為抗動脈粥樣硬化研究領域的重點和難點。本論文綜合采用計算機輔助藥物分子設計中藥效團篩選和分子對接方法從傳統中藥數據庫中快速篩選出PPARα的天然配體，為新型治療動脈粥樣硬化藥物的研發提供先導化合物。

1　方法與計算

1.1數據庫的選取及處理采用由臺灣中國醫藥大學ChenCY教授建立的傳統中藥數據庫TCMDatabase@Taiwan[14]進行虛擬篩選。該數據庫是目前世界上最大、最全面的中藥類數據庫，包含352種中草藥，共計37 170個化合物。使用Accelrys公司的PipelinePilot8.5軟件對該數據庫進行以下處理，去除重復分子，經處理后，共輸出8 710個活性化合物，然后采用Lipinski的類藥性五規則，用于對化合物庫的初篩，最終得到5 324個候選化合物。

1.2藥效團構建從蛋白質晶體的結構數據庫中獲得16個對PPARα有明確激動活性的小分子配體，按照結合位置比較挑選出5個與受體結合位點一致的配體作為訓練集，使用DiscoveryStudio3.5軟件中的DSCatalystConformation進行多構象化設置，對每個小分子產生最多255個構象用以表征小分子的構象空間，創建能量值在能量閾值20kcal·mol-1之內的構象。然后，由Receptor-LigandPharmacophoreGeneration(RLPG)模塊進行PPARα激動劑藥效團模型的構建。使用DSCatalystStructureBasedPharmacophore(SBP)生成具有4～8個特征元素的20種藥效團模型。通過藥效團特征元素聚類分析和與活性化合物的活性值匹配情況進行比較，選擇最優的藥效團模型進行后續的篩選。

1.3藥效團篩選和分子對接利用上述得到的較優藥效團模型5號藥效團對5 324個候選化合物進行虛擬篩選，為了得到多樣性良好的先導化合物，對所有候選化合物進行結構聚類分析，從中挑選出打分最好的化合物作為候選分子。分子對接是2個或多個分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識別的過程，是最重要的計算機輔助藥物分子設計方法之一[15]。使用DSLigandFit模塊，將上述藥效團篩選后的20種候選化合物分別與PPARα受體進行分子對接，通過對打分函數分析及受體與配體之間的相互作用模式確定先導化合物。

2　結果與討論

2.1藥效團模型評估根據訓練集化合物所含藥效團特征構建出20個藥效團模型。通過對已知的活性化合物建立測試集驗證模型，區分活性化合物能力和篩選能力，從而優選出適合用于進一步篩選的藥效團模型。通過對20種藥效團模型進行評估，結果表明，Pharmacophore5， 8， 10， 12， 14， 16， 18， 19和20的SE均為0.800 00，較其他藥效團模型得分較高。根據對幾種得分較高藥效團模型的綜合比較，我們最終選定5號藥效團作為后續篩選的藥效團模型。5號藥效團具有2個氫鍵受體(hydrogen-bondacceptor，HBA)，4個疏水基團(hydrophobicpoint，HY)和27個排除體積(excludedvolumes，EV)，其與陽性對照物BMS-687453的匹配圖見圖1。由圖1可知，BMS-687453結構中的羧酸端羰基和羥基與氫鍵受體特征匹配，而結構中的2個芳香環、1個五元環及與酯基連接的甲基與疏水中心特征匹配。

Fig.1MappingofPPARαagonistpharmacophoremodel5#andcompoundBMS-687453inthetrainingset

2.2藥效團篩選傳統中藥數據庫TCMDatabase@Taiwan是由臺灣中國醫藥大學建立的免費虛擬篩選數據庫，包含352種中草藥，共計約4萬種中藥成分化合物。利用所得較優的5號藥效團模型，對該數據庫進行虛擬篩選，通過除重、Lipinski的類藥性五規則和藥效團篩選等一系列操作，初步得到20個命中結構，見圖2。

圖2測試集化合物的結構示意圖

Fig.2Thechemicalstructuresofthetestsetcompounds

2.3分子對接由于得到的活性化合物較多，為了進一步分析這些化合物與PPARα活性位點的相互作用，選取PDB數據庫中的PPARα與BMS-687453復合物晶體結構中的蛋白作為受體(PDBID:3KDT)[16]，利用DS中Libdock模塊將這20個命中結構分別對接到受體的活性位點，提取對接構象后，采用ScoreLigandPose通過不同的打分函數對構象進行打分，主要包括：LigScore，PLP，PMF，Jain和Ludi等。為了合理地選擇打分函數，繪制5種訓練集化合物的所有打分函數與活性IC50值的散點圖，計算各個模型的線性回歸系數。結果表明，Jain和Ludi具有最高的線性系數，因此，我們選擇這2種打分函數作為評判標準，列出了20種命中化合物的打分函數Jain和Ludi值，見表1。根據訓練集化合物打分與富集率的關系，我們認為：化合物的Jain值在0.568 5～2.647 5之間，或其Ludi值的范圍在820～1 030之間，可作為選擇候選藥物分子的依據。據此，化合物3，8，10，11，14，16和20可作為潛在的藥物分子。

表120個測試集化合物的Jain和Ludi打分函數值

Tab.1ResultsofJainandLudiscoringfunctionsfor20testsetcompounds

序號JainLudi序號JainLudi1-0.06307111.7359224.00598125.7464931.54303133.9469344.14669142.2664253.22745155.2576263.40602161.2745170.39522173.6256882.35363184.0966592.66594193.98600105.378242010.10884

2.4相互作用模式分析對PPARα的晶體結構進行分析可以看出，PPARα受體的13個α螺旋和1個小四鏈體的β片層共同組成1個“Y”型的疏水口袋，該疏水口袋即受體與配體的結合區域。PPARα激動劑大多含有1個酸性的頭部基團、1個疏水的尾部基團和1個中間的連接部分，以訓練集化合物BMS-687453為例，PPARα受體與BMS-687453結合區域及氫鍵相互作用的結構見圖3。由圖3可知，BMS-687453的酸性頭部基團與尾部的疏水基團以1個“U”型結構與受體結合,見圖3(a)。酸性端的O原子作為氫鍵受體，與PPAR受體上的殘基Cys276、Ser280、Tyr314、His440和Tyr464形成5個氫鍵，見圖3(b)和(c)。這種氫鍵在受體與配體的結合過程中起著至關重要的作用。另外幾種訓練集化合物與受體形成氫鍵的情況分別為：AZ242與受體上殘基Tyr314(2個氫鍵)和Tyr464形成3個氫鍵；CTM與受體上殘基Tyr314和Ser280形成2個氫鍵；GW6471與受體上殘基Tyr314和Phe273形成2個氫鍵；NKS與受體上殘基Cys276、Ser280、Tyr314和Tyr464形成4個氫鍵。根據訓練集化合物與受體形成氫鍵的情況可以看出，PPARα受體的殘基Cys276、Ser280、Tyr314和Tyr464是形成氫鍵的主要殘基，這些氨基酸殘基與配體形成的氫鍵網絡可以使AF-2(Activationfunction-2)螺旋穩定于一種構象，從而使PPAR處于激活構象，實現基因表達的調控。另外，配體尾部疏水部分與受體的疏水臂形成較強的疏水作用，可增強化合物與受體的結合力。

圖3PPARα受體和陽性對照物BMS-687453的結構示意圖

a.結合圖;b.三維結構示意圖;c.相互作用平面示意圖

Fig.3ThestructuregraphsofthePPARαreceptorandBMS-687453a.bindingregion;b.three-dimensionalstructuregraph;c.planeschematicofinteractionbetweenthereceptorandligand

PPARα受體和陽性對照物BMS-687453的結構示意圖見圖4。由圖4可知，經打分函數后確定的7種潛在藥物先導化合物與PPARα受體的氫鍵作用圖可以看出化合物3與殘基Tyr314、SER280和TYR464形成3個氫鍵；化合物8與殘基SER280、TYR314(2個)和TYR464形成4個氫鍵；化合物10與殘基SER280形成1個氫鍵；化合物11與受體無氫鍵形成；化合物14和16均與殘基TYR464形成1個氫鍵；化合物20與CYS276、SER280、TYR314和TYR464形成4個氫鍵。綜合考慮打分函數及氫鍵的相互作用，化合物3，8和20與PPARα受體的結合能力較好。為了進一步證明這種結合體現的是配體對受體的激動作用，我們將化合物3，8和20分別與處于激活狀態和非激活狀態的受體進行分子對接，對接后與激活態的打分值分別為：66.22,95.32和152.66，與非激活態的打分值分別為：53.21,88.24和125.72。結果表明，這3種化合物與激活狀態下的受體打分明顯高于非激活狀態下的受體。綜上所述，經過計算機虛擬篩選獲得的3種化合物可作為PPARα激動劑的候選藥物分子，為今后的實驗驗證及臨床研究奠定基礎。

圖4PPARα受體和7種先導化合物間氫鍵相互作用示意圖

Fig.4TheschematicofthehydrogenbondinteractionsbetweenthePPARαreceptorand7leadcompounds

3　結論

本文通過對傳統中藥數據庫進行虛擬篩選，從傳統中藥中獲得具有潛在抗動脈粥樣硬化作用的PPARα激動劑。通過虛擬篩選得到了20個結合模式合理的化合物，對這些小分子配體與PPARα受體結構進行了分子對接，通過比較打分函數及氫鍵的相互作用分析共得到了3個理論上與受體結合能力較好的、可作為PPARα受體激動劑的化合物。本文的結果可為研究從傳統中藥中尋找新型抗動脈粥樣硬化藥物提供可靠的理論依據。

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The virtual screening of anti-atherosclerosis PPARα agonists in traditional Chinese medicines

DU Xia1，ZHANG Xinlei2，LI Ye1*

(1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Xi′an 710003，China；2.School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)

ObjectiveTodiscoverthepotentialanti-atherosclerosisdrugsbasedonthetraditionalChinesemedicines.MethodsTheperoxisomeproliferators-activatedreceptorαagonist(PPARαagonist)isoneofthehotspotsfortreatingatherosclerosis.Inthispaper，acomputer-aideddrugdesign(CADD)methodwasusedtoperformthevirtualscreeningoftraditionalChinesemedicinedatabasebasedonthetargetPPARα ，suchaspharmacophorescreening，moleculardockingandanalysisoftheinteraction.ResultsWefound20compoundsfromthetraditionalChinesemedicinedatabase，whichcontains37 170compoundsinall，andweeventuallyconfirmed3leadcompoundsbyfurtherusingtheanalysisofthehydrogenbondinginteractions.ConclusionTheresultsprovideareferenceforthediscoveryofnewanti-atherosclerosisPPARαagonists.

atherosclerosis；PPARαagonist；pharmacophorescreening；moleculardocking

陜西省中醫管理局中醫藥課題(編號：15-ZY017)

杜霞，女，博士

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.019

R914

A

1004-2407(2016)05-0505-04

李曄，女，研究員

2015-11-02)