急性髓系白血病Galectin-1基因甲基化研究

羅雅月，尹朝晟，付翔杰，張魏，劉娟，譚潭

1.南華大學附屬郴州市第一人民醫院門診部，湖南郴州 423000；2.南華大學附屬郴州市第一人民醫院檢驗醫學中心，湖南郴州 423000

*論著*

急性髓系白血病Galectin-1基因甲基化研究

羅雅月1，尹朝晟2，付翔杰2，張魏2，劉娟2，譚潭2

1.南華大學附屬郴州市第一人民醫院門診部，湖南郴州 423000；2.南華大學附屬郴州市第一人民醫院檢驗醫學中心，湖南郴州 423000

目的 檢測急性髓系白血病（AML）中Galectin-1基因的甲基化水平，探討Galectin-1基因表達水平與啟動子甲基化的關系。方法 選取2014年1月—2015年12月在該院門診部治療前AML骨髓54例、對照骨髓35例和治療后完全緩解AML骨髓8例，采用采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)方法檢測Galectin-1基因甲基化狀態。 結果 Galectin-1基因在AML骨髓中的平均表達水平明顯低于對照骨髓 （0.35±0.09）VS（0.87±0.22），在完全緩解AML骨髓中明顯高于治療前骨髓 （0.79±0.21）VS（0.33±0.11）；Galectin-1基因在AML骨髓的甲基化陽性率明顯高于對照骨髓 (79.6%VS 17.1%)，Galectin-1基因的甲基化陽性率在完全緩解AML骨髓中明顯低于治療前骨髓 (12.5%VS 75.0%)；Galectin-1基因表達水平與其甲基化呈負相關。結論Galectin-1基因在AML中出現表達下調或缺失，與其啟動子甲基化有關。

急性髓系白血病；Galectin-1；甲基化

白血病是最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的身體健康。研究表明，白血病的發生和發展是一個多因素、多步驟復雜的過程，涉及到相應的遺傳學與表觀遺傳學方面的改變[1]。DNA異常甲基化在人類許多腫瘤中是比較常見的表觀遺傳學改變，也是導致基因表達變化主要原因之一[2-3]。通過逆轉基因的甲基化狀態也就是去甲基化，可以恢復相關基因的表達水平，是臨床上靶向治療的熱點方向。因此，通過研究有關白血病的甲基化沉默基因，可有助于闡明白血病的發病分子機制，在臨床上為白血病的防治提供新的靶標和研究思路。

半乳糖凝集素I（Galectin-1）是一種典型的真核細胞胞漿蛋白，Galectin-1在人體許多組織中均有表，其廣泛分布說明它是一種多功能蛋白質，在細胞的多種生物學過程中起著重要的作用，研究發現，Galectin-1在糖類識別、細胞黏附、細胞生長、細胞凋亡等生物學活動中具有重要作用[4]；在許多腫瘤中，Galectin-1的表達均增高，與腫瘤的發生發展有關[5-6]。該研究選取2014年1月—2015年12月AML骨髓54例及對照組骨髓35例及經治療后完全緩解的AML骨髓8例，通過檢測Galectin-1在其中的表達水平和甲基化狀態，探討Galectin-1在AML發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

試劑DNA甲基化試劑盒 (EZ DNA Methylation-Gold Kit)。

1.2 骨髓樣本

2014年1月—2015年12月在該院門診部初治AML骨髓標本54例（其中男30例，女24例，年齡13～81歲），其中經治療后完全緩解的AML骨髓標本8例 （其中男5例，女3例，年齡13～52歲），以及對照組骨髓標本35例（貧血及血小板減少病人，其中男20例，女15例，年齡20～56歲）均來自中南大學湘雅醫院的門診和住院病人。AML病人診斷均符合FAB診斷和分型標準。

1.3 骨髓標本的制備

取肝素抗凝骨髓液3 mL，用分層液分選單個核細胞，每一個標本均分成2份，凍存于-80℃冰箱，用于后續實驗。

1.4 提取純化DNA

甲基化特異性PCR（MSP-PCR）抽提骨髓細胞的基因組DNA，采用DNA甲基化檢測試劑盒對待測的DNA進行重亞硫酸鹽修飾并純化。PCR反應條件設置如下：94℃5 min，1個循環；94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環；72℃延伸8 min。反應結束后，取5 μL PCR產物于2.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，紫外燈下觀察并掃描圖片。

1.5 統計方法

用SPSS 17.0統計學軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，兩組均數之間的比較采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Galectin-1基因在AML骨髓中的表達

Galectin-1基因表達水平在AML骨髓中明顯低于對照組骨髓 （0.35±0.09）VS（0.87±0.22）（圖 1，t=11.124，P= 0.000）。Galectin-1基因平均表達水平在完全緩解AML骨髓中明顯高于治療前骨髓（0.79±0.21）VS（0.33±0.11）（圖1，t=9.512，P=0.000）。

圖1 Galectin-1基因表達水平

2.2 Galectin-1基因在AML骨髓中的甲基化狀態

AML骨髓 Galectin-1基因甲基化陽性率為79.6%（43/54），對照組陽性率為17.1%（6/35），AML骨髓甲基化陽性率明顯高于對照組（χ2=33.510、P=0.000）。Galectin-1甲基化陽性率在治療前AML骨髓為75.0%(6/8)，而在完全緩解AML骨髓為12.5﹪(1/8)，兩者之間的差異有統計學意義（χ2=6.349、P=0.012）。

表1 Galectin-1基因在AML骨髓中的甲基化狀態

3 討論

DNA甲基化修飾是白血病發生發展過程中相當普遍的一種表觀遺傳學改變，它在白血病的發生發展過程中具有重要作用。尋找白血病的有關甲基化沉默基因，將有助于闡明白血病的發病分子機制以及尋找新的白血病治療靶標。半乳糖凝集素(Galectin)是動物凝集素家族當中的一員，目前已發現的Galectin家族成員有14個，在人類中，至少有12種Galectin分子，它具有多種生物學功能，Galectin-1在在多種腫瘤細胞中高表達，臨床上可作為許多腫瘤的分子靶標，具有調節細胞之間、細胞與基質之間的相互作用，參與細胞的增殖、分化和凋亡等[7]。研究發現，Galectin-1在胃癌中表達陽性率為63%，Galectin-1高表達與腫瘤的大小、分化程度、TNM分期、轉移有關[8]。

研究發現，Galectin-1主要功能是通過阻斷S/G2細胞周期，從而可以抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導腫瘤細胞發生凋亡[9-10]。Galectin-1啟動子區的堿基對大約有250個，其啟動子區發生甲基化，是Galectin-1基因表達沉默的主要原因之一[11]。有研究發現，在T細胞白血病細胞中，檢測到了Galectin-1基因啟動子甲基化[12]。Galectin-1基因在結腸癌細胞株中出現甲基化，與細胞凋亡有關[13]。

為了解Galectin-1基因在AML中的表達水平及基因甲基化之間的關系，該研究選取初治和完全緩解的AML患者、正常對照為研究對象，檢測Galectin-1基因的甲基化情況。結果表明，在正常對照組Galectin-1表達明顯高于AML患者，經過治療完全緩解后其表達量增加。而該基因甲基化狀態情況則與之相反，AML中Galectin-1基因甲基化陽性率為81%，正常對照甲基化陽性率為14%，完全緩解期仍為陽性可能預示著復發。Galectin-1基因表達水平和甲基化之間存在負相關性，與上述研究報道一致。因此，該研究認為Galectin-1基因啟動子區出現甲基化可能是導致該基因沉默的主要原因之一。

綜上所述，在AML中，Galectin-1基因出現高甲基化導致其表達下調，Galectin-1基因作為一個候選的抑癌基因，其表達缺失在AML生發展過程中具有重要的作用。但由于臨床上AML完全緩解的骨髓樣本量較少，有關Galectin-1甲基化在AML治療過程中的應用價值仍需進一步研究，擴大樣本量有助于進一步明確Galectin-1與AML預后之間的關系，可為臨床上提供一種監測AML預后與復發的標記物。

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Study of Methylation of Galectin-1 Gene in Patients with Acute Myeloid Leukemia

LUO Ya-yue1,YIN Zhao-sheng2,FU Xiang-jie2,ZHANG Wei2,LIU Juan2,TAN Tan2
1.The Outpatient Department,Chenzhou First People's Hospital Affiliated to University to South China,Chenzhou,Hunan Province, 413000 China；2.Center for Laboratory Medicine of Chenzhou First People's Hospital Affiliated to University of South China,Chenzhou Hunan Province,423000 China

Objective To detect acute myeloid leukemia (AML)methylation status of Galectin-1 gene,to investigate the expression and promoter methylation.Methods Our out-patient department,54 patients during January 2014 to December 2015 with AML before the treatment of bone marrow,bone marrow of 35 cases of the control and 8 cases of complete remission after treatment of AML bone marrow samples by methylation specific PCR (MS-PCR)to detect the methylation status of Galectin-1 gene.Results Galectin-1 gene expression levels in bone marrow in average AML was significantly lower than the control of bone marrow(0.35±0.09)VS(0.87±0.22)in complete remission,average expression level of AML in bone marrow was significantly higher than that before treatment of bone marrow(0.79±0.21)VS (0.33±0.11);Galectin-1 gene in bone marrow of methyl AML positive rate was significantly higher in the bone marrow(79.6%VS 17.1%),in complete remission in the bone marrow of methyl AML positive rate was significantly lower than before treatment(12.5%VS 75%);the expression level of Galectin-1 gene and its methylation negative correlation.Conclusion Galectin-1 gene in AML table Up to down or missing,and its promoter methylation related.

Acute Myeloid Leukemia；Galectin-1；Methylation

R733.71

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.02.01

2016-03-27；

2016-04-13

湖南省衛生廳科研計劃項目（B2010-127）。

羅雅月（1982.10-），女，湖南郴州人，主治醫師，在讀研究生，研究方向：腫瘤學，白血病發病機制。

譚潭（1980.1-），男，湖南祁陽人，碩士，主管檢驗師，碩士生導師，研究方向：白血病發病機制，E-mail:tantan1413@126.com。