艾燃燒生成物對ApoE基因敲除小鼠腦內神經遞質5-HT、GABA的影響

王　昊　楊　佳　趙百孝　哈　略　劉耀萌　黃　暢　于夢蕓　惠　鑫　和　蕊　韓　麗

(北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，100029)

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艾燃燒生成物對ApoE基因敲除小鼠腦內神經遞質5-HT、GABA的影響

王昊楊佳趙百孝哈略劉耀萌黃暢于夢蕓惠鑫和蕊韓麗

(北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，100029)

目的：觀察艾燃燒生成物即艾煙對載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)大腦內神經遞質5羥色胺(5-HT)和γ-氨基丁酸(GABA)含量變化的影響。方法：本實驗選用8周齡載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)21只，7只同齡相同遺傳背景非轉基因小鼠C57BL/6作為空白對照組。ApoE-/-小鼠隨機平均分為艾煙組、模型對照組、氯吡格雷組。艾煙組小鼠5～15 mg/m3濃度艾煙干預，空白對照組和模型對照組小鼠空白抓取，氯吡格雷組口服給予氯吡格雷溶液14 mg/kg(1次/d)，各組干預6 d/周，16周后犧牲動物，使用LC-MS/MS同時測定腦組織中神經遞質GABA、5-HT含量。結果：艾煙組其腦內5-HT、GABA的含量顯著高于模型組(P<0.05)，氯吡格雷組腦內5-HT與模型組無明顯差異，GABA的含量顯著高于模型組(P<0.05)，3組間均具有統計學意義(P<0.05)。結論：適當施灸時，一定濃度范圍之內的艾燃燒生成物可以治療性提高ApoE-/-小鼠腦內5-HT及GABA的含量。

艾燃燒生成物；ApoE基因敲除小鼠；神經遞質；5-HT；GABA

艾灸是用艾葉制成灸材，點燃后通過熱輻射刺激體表穴位或特定部位激發經氣和通過呼吸吸入具有芳香氣味的艾煙，共同調整人體生理功能，從而達到防病治病目的一種傳統中醫療法。艾灸療法的作用主要有溫通經脈、升陽舉陷、散寒祛濕、消腫散結、祛瘀通絡、回陽救逆等作用，其保健強壯、鼓舞正氣的效果較好，故該療法廣泛應用于日常養生。艾燃燒生成物即艾煙，可通過呼吸或皮膚吸收等途徑進入人體[1]，其成分復雜，主要作用成分可能為桉油精、龍腦、側柏酮、β-石竹烯等揮發油[2-3]，但目前仍尚未探明具體是哪種成分及其作用機制。

本課題組致力于艾灸及艾燃燒生成物作用機制的相關研究。在之前的研究中，我們發現艾煙具有抗氧化、光譜殺菌、抗病毒、抗腫瘤、調節腦內氨基酸類神經遞質、減少血小板聚集、改善微循環[4]、保護海馬CA3區、減少Aβ沉淀[5]等作用，從而改善小鼠學習記憶能力，進而起到延緩腦組織衰老，預防和改善阿茲海默病癥狀的作用。

ApoE載脂蛋白基因敲除(ApoE-/-)小鼠是由美國Rockefeller大學生化遺傳與代謝實驗室和北卡羅萊那大學病理遺傳實驗室于1992年采用胚胎干細胞基因敲除(gene knockout)技術培育成功，能夠在自然膳食下形成嚴重的高脂血癥，并自發形成纖維斑塊和復合斑塊，病理學改變與人類極為相似，因此廣泛應用于動脈粥樣硬化的研究中[6]。隨著ApoE4與阿茲海默病(Alzheimer Disease，AD)間相關性的發現與逐步證實，ApoE-/-小鼠成為研究ApoE在神經系統內功能以及ApoE基因缺失后可能出現的神經功能障礙的最佳動物模型。研究發現ApoE-/-小鼠在受到缺血性損害后，神經細胞的損害更加嚴重，而給予植入ApoE基因后，神經損害又大大減輕，這進一步支持ApoE的神經保護功能[7-8]。ApoE-/-小鼠出現認知障礙與膽堿能神經功能障礙[9-11]，而這兩者又是AD的主要特征，膽堿能神經受損被認為是AD認知功障礙的主要原因，因此ApoE-/-小鼠已經被作為一種新型動物模型，應用于研究ApoE缺失在乙酰膽堿神經損害所致認知障礙過程中發揮的作用[12]。劉鈞天[5]證明了ApoE-/-小鼠可以作為阿茨海默病的動物模型,并說明艾煙的確可以降低ApoE-/-小鼠的腦內淀粉蛋白沉淀，改善其學習記憶功能，進而起到延緩腦組織衰老，防治AD的作用。

本實驗選用ApoE基因敲除小鼠，觀察艾煙干預對小鼠腦內神經遞質5-HT、GABA含量變化的影響，探討艾煙抗衰老的作用效應。

1　實驗材料

1.1實驗動物本實驗選用8周齡載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)21只，7只同齡相同遺傳背景非轉基因小鼠C57BL/6作為空白對照組。小鼠均購自于北京大學醫學部實驗動物科學部。ApoE-/-小鼠釆用高脂飼料(北京維通利華實驗動物有限公司提供,含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸)喂養,C57BL/6釆用常規飼料喂養。所有小鼠均可自由進食飲水；飼養環境溫度為(22±2)℃，濕度為50%～60%左右。釆用人工控制室內照明，保持12 h光照(8：00—20：00)和黑暗(20:00—次日8：00)交替循環。

1.2主要儀器與試劑Q-Trap 5500型串聯四級桿-離子阱質譜分析儀(美國Applied Biosystems公司)，Sorvall Legend Micro 17R微量離心機(美國Thermo公司)，超低溫冰箱,日本三洋公司產，XS105S十萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，Gilson移液器(法國Gilson公司)。特制細艾條(φ0.5 cm×20 cm,河南南陽漢醫艾絨有限公司)；小鼠固定籠(自制,圓柱形,底面直徑5 cm,高10 cm)；帶孔玻璃缸(自制,80 cm×80 cm×60 cm,頂層玻璃正中設有直徑為5 mm的圓孔；光散射式數字粉塵測試儀(北京賓達綠創科技有限公司)。5-HT，GABA均購自美國Sigma公司，甲醇、乙腈為色譜純，實驗用水為超純水，其余試劑均為分析純。

2　實驗方法

2.1分組小鼠適應性飼養1周之后，將ApoE-/-小鼠按隨機數字表法隨機平均分為艾煙組、模型對照組、氯吡格雷組，每組7只，高脂喂養，空白組選用C57BL/6小鼠作為對照，普通飲食喂養。

空白組小鼠：釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，不予任何處理，每日抓取固定20 min；

模型組：釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，不予任何處理，每日抓取固定20 min；

艾煙干預組小鼠：釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，暴露于10～15 mg/m3艾煙環境下20 min；

陽性藥組小鼠：釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，不予任何處理，每日抓取固定20 min；口服給予氯吡格雷溶液14 mg/kg(1次/d)；

各組干預6 d/周，16周后犧牲動物，檢測各項指標。

2.2干預方法模型組與空白組小鼠：分別用自制小鼠固定籠固定后放入玻璃缸內,不做其他處理，20 min后取出。

艾煙干預組小鼠：將調試好的粉塵測試儀置于玻璃缸中間,將小鼠用自制小鼠固定籠固定后放于玻璃缸內。點燃細艾條,從玻璃缸上方圓孔中將燃燒的一端插入，令艾煙充滿玻璃缸。用粉塵測試儀測試其濃度達到預定范圍10～15 mg/m3后(此過程艾條燃燒約15 s)，將艾條取出,迅速封閉圓孔。此后每隔3 min記錄1次濃度數值，使數值保持在10 mg/m3左右。若數值高于15 mg/m3，可將上方玻璃蓋稍微移動，令艾煙散去部分后迅速將蓋子移回；若數值低于5 mg/m3，可再將點燃的艾條由圓孔插入,以補充艾煙。每次艾煙干預結束后,打開玻璃缸釋放艾煙，并擦拭玻璃缸清除艾燃燒殘留物，以便下次實驗操作。

2.3取材在干預16周后，將所有小鼠處死，冰臺上快速取腦。將取得的腦組織放入標記的凍存管中，液氮凍存數分鐘后移入-70 ℃冰箱待檢。

2.4指標檢測腦樣品稱重后，徹底剪碎(約100下)；下丘腦中分別加入0.2 mL生理鹽水，然后在冰浴中超聲勻漿得腦勻漿液。取各腦勻漿液0.15 mL，加入0.3 mL冰冷的乙腈，混勻后于4 ℃放置30 min，然后于4 ℃低溫離心(8 000 r/min，3 min)，取上清液200 μL，在其中加入10 μL內標，然后5 000 g低溫離心10 min后取上清液在LC-MS上測試。

TSKgel Amide-80色譜柱(2.0 mm×15 cm，3 μm)，柱溫35 ℃，流動相乙腈-15 mmol·L-1甲酸銨水溶液(pH5.5)(60∶40)，流速0.4 mL·min-1。質譜檢測器采用電噴霧電離方式進行離子化，以正離子多反應檢測(MRM)模式進行掃描，離子源及其他相關參數優化為噴霧電壓4 500V，加熱溫度500 ℃，Gas1 50Psi，Gas2 70Psi。

3　統計學方法

4　結果

各組小鼠腦內神經遞質5-HT和GABA含量比較見表1和圖1、圖2。

與空白對照組對比，模型組小鼠腦內5-HT、GABA含量明顯下降，差異有統計學意義。艾煙組腦內神經遞質5-HT和GABA含量介于模型組和空白組之間，顯著高于模型組，P<0.01，差異有統計學意義。氯吡格雷組小鼠腦內5-HT和GABA含量略高于模型組，但差異無統計學意義，低于艾煙組，P<0.05，差異有統計學意義，見圖1。

表1　各組小鼠腦內神經遞質5-HT和GABA含量比較

注：與空白對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

5　討論

中樞系統的5-HT神經元胞體主要集中在低位腦干的中線附近，稱為中縫核群，向前投射至前腦，向兩側投射至新皮質的廣泛區域，5-HT為單胺類神經遞質。作為中樞神經系統重要的神經遞質，其含量占全身總量的1%～2%，而腦內5-HT能神經遞質在記憶功能中起著非常重要的作用，另外同樣重要的還有膽堿能、兒茶酚胺能神經遞質[13]。5-HT被認為可通過與腦內乙酰膽堿的交互作用直接與記憶發生聯系。

圖1　各組5-HT和GABA含量對比

GABA是一種重要的抑制性神經遞質，正常的工作記憶功能取決于背外側前額皮層適量的GABA的神經傳遞，GABA的過少和過多釋放都會損害記憶[14]。衰老時GABA含量的下降可進一步造成機體的抗氧化能力減弱，繼而引發一系列的病理生理變化，最終導致神經元的損傷、凋亡，出現記憶力下降、認知障礙、思維遲緩等腦老化的表現。

中樞神經系統是一個耗能高、耗氧高的高代謝系統，其本身又含有高濃度易于氧化的物質，這導致中樞神經系統極易受到氧化應激的損傷，脂質過氧化是最早的改變之一。楊秀麗[12]發現，ApoE-/-小鼠腦內的氧化性產物增多，其抗氧化系統受到明顯的損害，這導致小鼠腦內氧化-抗氧化系統失衡，產生氧化應激，而這可能是最終導致小鼠認知功能障礙的根本原因。

本實驗結果顯示，使用艾煙處理小鼠后神經遞質含量明顯高于模型組，接近于空白組水平，說明其治療效果良好，艾煙生成物即艾煙作為艾灸作用因素之一可有效提高腦內神經遞質5-HT和GABA含量，起到延緩腦組織衰老的作用。本課題組之前的試驗已證明艾煙可減少ApoE-/-小鼠的腦內Aβ蛋白沉淀[5]，降低GFAP蛋白在海馬的表達水平[15]，改善學習記憶功能，其作用途徑可能是艾煙中有效揮發油成分，被呼吸系統和皮膚的黏膜吸收，調節神經遞質和脂質代謝，增強神經系統興奮性，改善腦內氧化應激損傷和炎性反應，從而起到預防和改善阿茲海默病癥狀的作用。

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(2016-06-28收稿責任編輯：洪志強)

Effects of Moxa Smoke on Brain 5-HT and GABA in Apolipoprotein E-deficient Mice

Wang Hao, Yang Jia, Zhao Baixiao,Ha Lue,Liu Yaomeng,Huang Chang,Yu Mengyun,Hui Xin,He Rui,Han Li

(SchoolofAcupuncture-MoxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effect of moxa smoke (Artemisia vulgaris) on neurotransmitters 5-HT and GABA in the brain of apolipoprotein E-deficient mice (ApoEKO) and explore the antiaging effect of moxa smoke. Methods: Seven eight-week old C57BL/6 mice were collected as control group, and twenty-one eight-week old ApoEKO mice were randomly divided into 3 groups (n=7/group): model group, moxa smoke group, and clopidogrel group. Mice in the smoke group was exposed to smoke, whose concentration is controlled within 5～15 mg/m3; mice in model group and control group were exposed to normal air. Mice in clopidogrel group were treated with 14 mg/kg clopidogrel orally once/day. After 16 weeks interference, the levels of 5-HT and GABA in the mice brain were measured. Results: Compared with the model group, the brain 5-HT and GABA levels of moxa smoke group were decreased significantly (P<0.05). There is no significant difference between the clopidogrel group and control group in 5-HT concentration, while GABA level was higher in clopidogrel group with significant difference (P<0.05), besides, the differences among the three groups have significant difference (P<0.05). Conclusion: Within appropriate concentration, moxa smoke can obviously increase brain 5-HT and GABA levels in ApoEKO mice.

Moxa smoke; Apolipoprotein E-deficient mice; Neurotransmitter; 5-HT; GABA

國家自然科學基金項目(編號：81373730)；國家自然科學基金項目(編號：81574068)；國家青年自然基金項目(編號：81403449)；國家國際科技合作專項項目(編號：2011DFA31370)

王昊(1991.01—)，男，北京中醫藥大學2015級在讀碩士研究生，研究方向：艾灸與艾燃燒生成物的效應機制，E-mail：wh_bucm@126.com

趙百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生導師，北京中醫藥大學針灸推拿學院院長，研究方向：艾灸作用與原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.005