高雄激素PCOS動物模型中抗苗勒管激素Ⅱ型受體蛋白及其基因甲基化分析

郝棟棟，殷倩，鐘興明，韋相才1，*，苗竹林，王永霞

(1．暨南大學附屬第一醫院婦產科，廣州　510632；2. 廣東省計劃生育科學技術研究所，廣州　510000)

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高雄激素PCOS動物模型中抗苗勒管激素Ⅱ型受體蛋白及其基因甲基化分析

郝棟棟1#，殷倩1#，鐘興明2，韋相才1，2*，苗竹林2，王永霞2

(1．暨南大學附屬第一醫院婦產科，廣州510632；2. 廣東省計劃生育科學技術研究所，廣州510000)

目的通過建立高雄激素誘導的多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠模型，探討抗苗勒管激素Ⅱ型受體(AMHR Ⅱ)在卵巢、子宮內膜中的表達及其基因啟動子區域甲基化與PCOS發病及局部病理變化的關系。方法45只雌性SD大鼠隨機分兩組：PCOS組皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)建立PCOS模型，對照組同期皮下注射等量生理鹽水；測定血清激素水平，結合卵巢組織HE染色切片結構改變評估PCOS模型；免疫組化法檢測卵巢、子宮內膜組織AMHR Ⅱ蛋白的表達與定位；通過甲基化特異性PCR(MSP)定性分析兩組大鼠血液、卵巢組織AMHR Ⅱ基因啟動子區域的甲基化狀態。結果血清性激素水平及卵巢切片結果均提示成功建立PCOS動物模型；免疫組化檢測顯示AMHR Ⅱ蛋白定位表達于細胞膜，在卵巢間質及卵泡顆粒細胞中均存在陽性表達，且在模型組中的表達強于對照組(P<0.05)；AMHR Ⅱ在子宮內膜中也存在表達，兩組之間表達無統計學差異(P>0.05)；MSP結果顯示兩組中血液及卵巢組織所有DNA樣本均檢出部分甲基化條帶，兩組之間無統計學差異(P>0.05)。結論AMHR Ⅱ可能參與了PCOS中AMH調控卵泡發育的過程，但與子宮內膜病變無明顯相關性；AMHRⅡ基因在啟動子區域存在著部分甲基化，但這種甲基化狀態與PCOS發病及局部組織病理變化無明顯相關。

抗苗勒管激素Ⅱ型受體；多囊卵巢綜合征；DNA甲基化；動物模型

【Abstract】

Objective：To study localization，distribution and expression of anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor (AMHR Ⅱ) in ovary and endometrium based on rat model of polycystic ovary syndrome (PCOS)，and explore the correlation between AMHR Ⅱ gene methylation and the local histopathological changes.

Methods：Forty five female Sprague-Dawley rats were grouped randomly into model group (PCOS model) subcutaneously injected with dehydroepiandrosterone (DHEA) and control group with sodium chloride instead. The levels of related reproductive hormones in serum were measured. The ovarian tissue of rats in every group underwent paraffin embedding，microsection，HE staining，and then patho-histological changes were observed to assess the establishment of PCOS model. The localization，distribution and semi-quantitative analysis of AMHR Ⅱ protein were determined by immunohistochemistry (IHC). The qualitative analysis of AMHR Ⅱ gene methylation in blood and ovarian tissues was performed by methylation-specific PCR (MS-PCR).

Results：The reproductive hormone levels and morphology analysis of tissue HE stained indicated that PCOS animal model was successfully established. IHC analysis showed that AMHR Ⅱ mainly located and expressed in cell membrane，and ovarian stroma and of granulosa cells of follicle presented positively expression. The expression was significantly higher in the model group than the control group (P<0.05). AMHR Ⅱ were also expressed in endometrial glandular epithelial cells and stromal cells，and there were no significant differences between the two groups (P>0.05). MSP qualitative analysis showed partial methylation occurred in the promoter region of AMHR Ⅱ genes in the blood and ovarian tissues in both groups，but without significant differences (P>0.05).

Conclusions：AMHR Ⅱ may be involved in the follicular development process regulated by AMH，but it may not be related to endometrial lesions. AMHR Ⅱ gene partial methylation in the promoter region may not be correlated with the local histopathological changes.

(JReprodMed2016，25(9)：832-837)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是以高雄激素、胰島素抵抗為主要表現的內分泌、代謝紊亂綜合征。PCOS至今發病機制不明，近年來有研究認為PCOS是一種卵源性疾病，卵巢局部調節因子的異常可能是導致PCOS一系列病理生理改變的重要因素[1]。抗苗勒管激素(AMH)是由卵巢顆粒細胞分泌的一種局部調節因子，在PCOS患者血清中明顯高于正常同齡婦女，且研究認為其與卵泡生長發育密切相關。抗苗勒管激素Ⅱ型受體(AMHR Ⅱ)是AMH作用的中間受體，它的表達是否參與或者以何種方式參與AMH調控卵泡發育的過程，研究報道不一。DNA甲基化是基因表觀遺傳修飾的重要方式，AMHRⅡ基因在PCOS中是否通過表觀遺傳學改變從而影響其在組織中的表達，鮮有報道。本實驗通過觀察高雄激素PCOS大鼠模型卵巢、子宮內膜等局部組織中AMHR Ⅱ蛋白的表達與分布，探討AMHR Ⅱ在PCOS局部組織病變發生發展中的作用；并對AMHRⅡ基因啟動子區域甲基化狀態進行定性分析，探討AMHRⅡ基因在PCOS中是否存在表觀遺傳學改變以及此種改變是否參與了AMHR Ⅱ表達調控。

材料與方法

一、實驗動物與試劑

清潔級SD雌性大鼠45只，均購自廣東省醫學動物實驗中心，動物許可證編號SCXK(粵)2008-0002，20～23日齡，體重40～55 g。

ELISA試劑盒購自上海信帆生物技術有限公司；兔抗鼠AMHR Ⅱ單克隆抗體購自美國abcam公司；組織DNA提取試劑DNA重亞硫酸鹽轉化試劑盒及甲基化特異性PCR試劑盒購自北京天根生物技術有限公司。

二、實驗方法

1. PCOS大鼠模型的建立：45只SD雌性大鼠隨機分為PCOS組(n=25)與正常對照組(n=20)。前者皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)6 mg/100 g/d，連續注射20 d，建立PCOS大鼠模型[2-3]；后者同期予以等量生理鹽水。兩組大鼠均喂以標準大鼠顆粒飼料，環境溫度20～23℃，濕度40%～60%，予清潔級飼養，每日光照10 h，自由飲水。

2. 標本的收集與病理檢測：兩組大鼠于6周齡始進行陰道脫落細胞涂片，于動情間期提前一天禁食，次日以3%戊巴比妥那(30 mg/kg，ip)麻醉，經腹主動脈一次性采血并分為抗凝與非抗凝兩管；取出雙側卵巢與子宮，一側卵巢迅速置于-80℃保存，用于后續提取組織DNA，子宮及另一側卵巢則迅速置于10%中性甲醛中固定24 h，以卵巢最大橫切面及子宮橫切面為待測面分別行HE染色與免疫組織化學染色。

3. 血清激素檢測：腹主動脈采取的非抗凝血在4 000 rpm離心10 min后分離上層血清-20℃保存。按照ELISA試劑盒說明書操作，測定血清睪酮(T)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)以及抗苗勒管激素(AMH)水平。

4. 免疫組織化學檢測AMHR Ⅱ蛋白的表達：采用鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶免疫組化法(SP 法) 檢測石蠟切片中AMHR Ⅱ。Ⅰ抗為兔抗鼠AMHR Ⅱ單克隆抗體1∶100 稀釋，Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體，用二氨基聯苯胺(DAB) 顯色。染色過程參照試劑盒說明操作，以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。卵巢、子宮內膜組織中AMHR Ⅱ蛋白半定量分析采用德國Lecia正立體式顯微鏡醫學圖像分析系統，陽性信號是指在細胞膜和胞漿內呈現棕黃色的顆粒，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野分別測定卵巢間質和卵泡、子宮內膜間質和腺體的AMHR Ⅱ蛋白表達水平。

5. 大鼠基因組DNA的提取：采用經典的酚氯仿法提取血液基因組DNA；大鼠卵巢組織于-80℃取出并按DNA提取試劑盒說明書操作提取組織DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分析儀檢測DNA的純度及濃度，于-20℃保存備用。

6. 大鼠基因組DNA中AMHRⅡ基因甲基化的檢測：采用甲基化特異性PCR定性分析AMHRⅡ基因啟動子區域的甲基化狀態。①在數據庫中查找AMHRⅡ基因相關序列，選擇位于AMHRⅡ基因轉錄起始位點上游的一段富含CpG位點的DNA序列，運用Meth Primer-Design 軟件進行AMHRⅡ基因甲基化特異性引物設計(表1)。②按DNA重亞硫酸鹽轉化試劑盒說明書將提取的DNA樣本予重亞硫酸鹽處理，處理后的DNA樣本做為模板DNA，根據甲基化特異性引物與非特異性引物分別加入兩個PCR管中，按照PCR試劑盒操作說明分別進行甲基化特異性PCR。③PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳以檢測有無目的條帶出現。

表1　AMHR II 甲基化特異性PCR引物設計

注：M為甲基化特異性引物，U為非甲基化特異性引物

三、統計方法

結　　果

一、PCOS動物模型的驗證

本實驗材料來自于同一基金支持下的并行項目[3]，按照本實驗室既往的方案，實驗動物造模成功：PCOS組血清T、E2、AMH水平均高于對照組，且LH/FSH比值升高；PCOS組卵巢組織總體呈典型多囊樣改變，子宮內膜增厚、腺體增多。

二、AMHR Ⅱ蛋白在卵巢、子宮內膜中的表達情況

1. 免疫組化蛋白定位結果：AMHR Ⅱ的表達主要定位于細胞膜，PCOS組與對照組中AMHR Ⅱ在子宮內膜腺上皮細胞及間質細胞中均存在著陽性表達(圖1A和1B)，兩者陽性表達無明顯差異。PCOS組AMHR Ⅱ在卵巢卵泡卵母細胞及顆粒細胞、卵泡膜細胞均有陽性表達，尤其是在顆粒細胞中表達，卵巢間質中見少量分布(圖1C)，而對照組AMHR Ⅱ主要在未成熟卵泡顆粒細胞表達，陽性率明顯低于PCOS組，卵泡外膜細胞、間質中見少量分布(圖1D)。

2. AMHR Ⅱ蛋白的相對定量結果：AMHR Ⅱ在PCOS大鼠卵巢卵泡及間質中表達較對照組增強，其分布在間質及卵泡中的差異均有統計學意義(P<0.05)；AMHR Ⅱ在大鼠子宮內膜腺上皮細胞表達較間質中增強，但PCOS組與對照組兩者間質及腺上皮細胞的灰度值分析顯示無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

3、AMHRⅡ基因甲基化檢測：在大鼠血液和卵巢基因組DNA中，PCOS組與對照組所有樣本中均在250 bp附近檢出了部分甲基化條帶(圖2)。電泳條件為：1%凝膠電泳，電壓為100 V，電流約20 mA。

A：PCOS組子宮內膜；B：對照組子宮內膜；C：PCOS組卵巢組織；D：對照組卵巢組織圖1　AMHR Ⅱ蛋白在PCOS組及對照組卵巢及子宮內膜組織的表達(免疫組化 ×200)

組別卵巢組織子宮內膜組織間質卵泡間質腺上皮細胞對照組113.73±3.93112.04±3.09110.37±11.9796.49±8.82PCOS組104.73±7.04*102.89±3.09*109.36±10.4288.41±8.93

注：與對照組比較，*P<0.05

M：甲基化特異性引物；U：非甲基化特異性引物；a：PCOS組；b：對照組；數字代表樣品編號圖2　大鼠卵巢及血液DNA中AMHR Ⅱ基因甲基化特異性PCR瓊脂糖凝膠圖像

討　　論

一、AMHR Ⅱ在PCOS生殖器官局部病理變化中的作用

AMH又稱為苗勒管抑制因子，最初在男性睪丸組織中發現，與男性胚胎性腺分化階段苗勒管的退化有關。在女性個體內，AMH主要由處于生長階段的卵泡顆粒細胞分泌，并與起始卵泡的募集與卵巢生長發育中優勢卵泡的產生有關[4]，其在血清中的濃度與卵巢中未成熟卵泡的數目有關。與TGF-β家族的其他成員一樣，AMH信號傳導需經過兩種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(AMHR I與AMHR Ⅱ)與兩種smad蛋白(受體調節smad蛋白R-Smad、普通smad蛋白smad4)。然而AMH主要通過AMHR Ⅱ(一種跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體)發生信號傳導，而不能通過其他Ⅱ型受體如骨基質發生蛋白Ⅱ型受體，激活素Ⅱ型受體等[5-6]。研究發現AMHRⅡ基因敲除的大鼠并不會出現苗勒管得退化，持續苗勒氏管綜合征患者中AMHRⅡ基因存在著突變[7]。

目前關于AMHR Ⅱ在卵巢、子宮內膜等生殖器官局部分布與表達的研究較少，AMHR Ⅱ是否參與了AMH調控卵泡生長發育的過程研究報道結論不一。姜宙等[8]認為AMH通過與卵丘顆粒細胞的特異性受體AMHR Ⅱ結合調控卵母細胞發育，且在卵泡中AMHR Ⅱ mRNA與AMH的表達量變化趨勢相同。Rice等[9]研究發現AMHR Ⅱ mRNA在多囊卵巢中的表達存在著特殊階段性，僅在少數始基卵泡、竇卵泡、次級卵泡中表達，并對AMH抑制卵泡募集提出了質疑。Li[10]等研究也發現在PCOS患者卵巢顆粒細胞中AMHR Ⅱ的mRNA與蛋白表達明顯增強。本實驗中PCOS模型組血清中AMH濃度明顯高于對照組，說明在PCOS大鼠血清中AMH濃度明顯升高，這也與國內外眾多研究一致。在大鼠卵巢免疫組化切片中發現AMHR Ⅱ在竇前卵泡及竇卵泡中都有表達，而在卵泡膜細胞及間質中也發現存在著少量陽性表達；本研究還發現在PCOS模型組AMHR Ⅱ在卵泡細胞(主要為顆粒細胞)的分布表達強于對照組。因此我們推測可能存在這樣的過程：PCOS中竇前卵泡及竇卵泡等未成熟卵泡的增多使得AMH分泌總量增加，血清中AMH濃度升高，AMH分泌量的增加上調了它的受體AMHR Ⅱ的表達，從而增強了其生物學作用抑制卵泡對FSH的敏感性，使卵泡的FSH閾值升高；而在卵巢間質的免疫組化切片中我們也發現存在著AMHR Ⅱ的陽性表達，推測AMH通過AMHR Ⅱ發揮作用的同時可能還受其他卵巢局部生長因子的調節。

國外研究報道[11]在人大腦組織中與TGF-β的激活相關的BMPR-IB(BMPR1B；Alk6)和Smad5依賴的信號轉導通路控制著neuroserpin轉錄，并推測是轉化生長因子β家族成員之一的AMH，促進人工培養神經元中neuroserpin的表達，間接表明了在卵巢以外的組織中可能存在著AMH所作用的受體。本研究發現AMHR Ⅱ蛋白在大鼠子宮內膜中同樣存在著陽性表達，但是PCOS模型組與對照組之間的表達強度并無明顯差異。這在國內是首次觀察到的結果。我們推測AMH可能通過AMHR Ⅱ在子宮內膜中發揮相應的生物學作用，而AMHR Ⅱ蛋白的表達量可能與PCOS導致的相應子宮內膜的病變無明顯相關性。但是不同基因背景的小鼠對DHEA誘導的反應存在一定的差異[12]，目前的小鼠模型都只模擬出了PCOS患者的部分臨床表現，集中在生殖方面的缺陷，PCOS的所有臨床特征還沒有在任何一種模型能夠模擬出[13]。而張少娣等[14]研究認為除了分型因素導致的差異，不同亞型PCOS的其他臨床生化特征無明顯差異。因此相關探討仍需較多實驗數據支持。

二、AMHRⅡ基因及其甲基化在PCOS中的作用

目前研究發現人類AMHRⅡ基因總長度為7.6 kb，位于12號染色體長臂，有11個外顯子。關于AMHRⅡ基因的研究，Rigon等[15]研究了76例特發性不孕與100例正常生育的女性，發現AMHRⅡ基因中-482 A>G、IVS 5-6 C>T、IVS 10+77 A>G、146T>G等位基因序列的多態性可能與特發性不孕相關。Kevenaar等[16]研究發現，AMHRⅡ基因多態性與PCOS發生相關，但胡蓉等[17]、Sproul等[18]研究則得出與之相反的結論。

PCOS是遺傳與環境相互作用的結果，DNA甲基化是表觀遺傳研究的熱點，那么在PCOS中是否也存在著基因表觀遺傳學方面的變化呢？因此我們以高雄激素的PCOS的大鼠模型為基礎，研究在AMHRⅡ基因的啟動子區域的某一片段在其血液及卵巢組織樣本中是否存在著甲基化方面的變化，以及這種變化與PCOS的發病與局部病理變化之間有無相關關系。本研究發現在PCOS大鼠與對照組大鼠的所有血液及卵巢組織樣本中，通過甲基化特異性PCR的方法均檢出了部分甲基化的條帶，兩組之間無統計學差異。我們推測在PCOS大鼠中，AMHRⅡ基因存在著部分甲基化狀態，但是這種甲基化狀態可能與PCOS的發病與局部卵巢病理變化無明顯相關關系。本實驗只是定性分析了AMHRⅡ基因的甲基化狀態，下一步需要運用重亞硫酸鹽測序法(BSP)去進一步分析，可能得出的結果會有所不同，或許會有更重要的意義。

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[編輯：辛玲]

Expression of anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor and its gene methylation in rat model of PCOS

HAO Dong-dong1#，YIN Qian1#，ZHONG Xing-ming2，WEI Xiang-cai1，2*，MIAO Zhu-lin2，WANG Yong-xia2

1.DepartmentofObstetrics&Gynecology，theFirstHospitalAffiliatedtoJinanUniversity，Guangzhou510632 2.FamilyPlanningScience&TechnologyResearchInstituteofGuangdongProvince，Guangzhou510000

Anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor；Polycystic ovary syndrome；DNA methylation；Animal model

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.013

2015-12-10；

2016-01-29

廣東省科技計劃項目(2009B030801270)；廣東省自然科學基金項目(10151008010000000)

郝棟棟，女，山東德州人，碩士，住院醫師，生殖內分泌專業；殷倩，女，湖北黃石人，碩士，住院醫師，生殖內分泌專業.(#共同第一作者；*

，Email：dxcwei@163.com)