臍血干細胞移植對小鼠腦梗死后神經功能的影響

潘曉峰　張細六　張　媚

1)武漢市第一醫院神經內科　武漢　430050　2)武漢市第五醫院　武漢　430050

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臍血干細胞移植對小鼠腦梗死后神經功能的影響

潘曉峰1)張細六1)張媚2)△

1)武漢市第一醫院神經內科武漢4300502)武漢市第五醫院武漢430050

目的探討臍血干細胞移植對小鼠腦梗死后神經功能的影響，以期為臨床治療提供依據。方法先對小鼠進行模型，隨機分成阿司匹林組、生理鹽水組和臍血干細胞移植組，分別造模后1 d灌胃生理鹽水、阿司匹林、臍血干細胞移植，觀察在血清NGF和神經功能變化情況。結果治療前3組間NGF水平、生理鹽水組和阿司匹林組治療28 d后比較差異無統計學意義(P>0.05)；余3組治療前后和治療后7、14、21、28 d比較差異均有統計學意義(P<0.05)。治療前神經功能均為0，治療后和治療前在神經功能評分上比較差異有統計學意義(P<0.05)；生理鹽水組組、阿司匹林組、臍血干細胞移植組治療后7、14、21、28 d神經功能評分兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論臍血干細胞移植能改善小鼠腦梗死后神經功能。

臍血干細胞移植；小鼠；腦梗死；神經功能

腦梗死是神經內科常見病和多發病，致殘率和致死率較高，其原因是神經元再生困難。研究[1]稱，神經突觸是神經元信息傳遞和加工重要結構，如何促進神經突觸再生是促進損傷神經修復的重要環節。而臍血干細胞能將干細胞轉移至缺血邊緣地帶，分化成膠質神經、血管內皮細胞，能促進新血管形成。本次研究通過觀察臍血干細胞移植對小鼠腦梗死后神經功能的影響，以期提高臨床診治水平。

1　資料與方法

1.1動物隨機選取75只小鼠為研究對象，分成3組，每組25只，均為雄性，平均體質量(45±5)g，入選動物均符合動物實驗要求，均飼養1周。

1.2實驗試劑試劑有胎牛血清、人淋巴細胞分離液、終止液、青鏈霉素、24孔培養板、CO培養箱、定量ELISA試劑盒，均由上海陽光生物科技有限公司。

1.3動物分組和模型制備隨機將所有小鼠分成阿司匹林組、生理鹽水組和臍血干細胞移植組，每組25只。

1.4觀察指標和方法先進行臍血干細胞分離，均取自自愿提供的孕婦中，排除攜帶病毒性肝炎、艾滋病和梅毒等感染，在采集12 h后進行單個核細胞分離，肝素抗凝后將臍血和PBS按1：1混勻后和5 g/L甲基纖維素按4：1混勻，吸取上層清液，棄除上層清液，用PBS制成單個細胞懸液，疊加淋巴細胞分離液上進行梯度離心，然后洗滌、反復吹打，制備成細胞懸液，將細胞調整成1×108/L保存，2 h內對小鼠進行細胞移植。對所有小鼠進行腦梗死模型制備，用水合氯醛腹腔注射麻醉，按照文獻[2]相關方法在大腦中動脈進行局限向栓塞。在頸中切開，結扎頸外動脈，用多聚賴氨酸處理尼龍線至大腦前動脈起始處，阻塞大腦中動脈主干起始部，1 d內觀察小鼠神經功能。所有模型均制備成功。然后對各組進行相應藥物治療，阿司匹林組組阿司匹林1 mg灌胃，生理鹽水組予3 mg/kg靜脈注射，1次/d，臍血干細胞移植組則在小鼠尾靜脈處注射3 mL人臍血干細胞1 mL磷酸緩沖液。

1.5觀察指標分別在實驗前、實驗后7 d、14 d、21 d、28 d，采集靜脈血2 mL，以4 000 r/min離心后分離血清，采用雙抗體夾心測定標本中神經生長因子(NGF)水平，觀察神經功能評分，包括運動、感覺、反射、平衡試驗，從0～18進行分級，正常為0分，最嚴重為功能缺損為18分[3]。

2　結果

2.13組血清NGF水平比較對3組血清NGF水平進行比較，治療前3組間NGF水平、生理鹽水組和阿司匹林組治療28 d后比較差異無統計學意義(P>0.05)；余3組治療前后和治療后7、14、21、28 d比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　3組血清NGF水平比較

注：A組、B組、C組分別代表生理鹽水組組、阿司匹林組、臍血干細胞移植組

2.23組神經功能比較對3組神經功能進行比較，治療前3組神經功能評分均為0，治療后和治療前神經功能評分比較差異有統計學意義(P<0.05)，生理鹽水組組、阿司匹林組、臍血干細胞移植組治療后7、14、21、28 d神經功能評分兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　3組神經功能比較

注：A組、B組、C組分別代表生理鹽水組組、阿司匹林組、臍血干細胞移植組

3　討論

目前用于中樞神經移植的供體細胞主要有胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞及臍血干細胞等。臍血干細胞是近年來發現的一類具有骨髓干細胞、外周血干細胞有相同多向分化潛能的原始祖細胞，能在特定因子的影響和誘導下向多種細胞或組織分化，能對腦梗死缺血及受損組織進行結構和功能的修復。且其自我更新能力強，具有高度未分化性和多向分化潛能，能替代死亡細胞誘導內源性神經再生，能釋放神經保護和免疫調節作用，其中臍血干細胞具有來源豐富、采集方便、抗原性弱、不受病毒和腫瘤污染特點。研究[4]稱，臍血干細胞中CD3、CD4細胞群占95%以上，能通過免疫調節多種血管活性物質，達到控制干細胞命運，且調節新生細胞數量和種類。

研究[5]稱，臍血干細胞移植治療腦卒中的機制是減輕炎癥反應，增加營養物質吸收，促進血管再生和神經纖維重塑，其中減輕炎癥反應主要是抑制淋巴細胞、中性粒細胞等浸潤、減少星形細胞等激活，腦梗死后會發生一系列炎癥反應，而臍血細胞則能通過影響炎癥級聯反應達到降低免疫反應，增加神經功能效果。研究[6-8]稱，臍血干細胞移植有以下幾個方面作用：(1)能分泌多種神經營養因子，如神經生長因子、膠質神經源性神經營養因子等，而這些因子中以神經生長因子最為重要，該因子能促進腦梗死后腦組織分化形成神經細胞，且能抑制病灶區域神經細胞凋亡，促進腦梗死神經細胞軸突生長和修復，在本次研究中得到明顯體現，和阿司匹林相類似。(2)能促進新血管生長，研究稱臍血干細胞能通過調節血管內皮細胞生長因子直接和間接作用，促進梗阻的微血管修復和再生能力，對神經修復有一定恢復作用。(3)能減少腦梗死區域炎癥水腫，縮短治療時間，研究稱，臍血干細胞能增強血液通透性，能抑制血小板聚集，降低白細胞介素1等炎癥因子反應。(4)臍血干細胞移植能減少損傷后局部神經細胞凋亡，從而起到保護神經功能作用。研究[9]稱，臍血干細胞移植后小鼠脊髓損傷組織內神經元和膠質細胞等Fas表達受到抑制，會造成有些神經信號傳導通路下調，促使XIAP表達增加，抑制神經細胞凋亡。

但需指出的是，臍血干細胞移植具有兩面性，其再生潛能修復組織能治療臨床上很多疾病，但其又具有復制性和克隆性，若不受控制生長則會演變為不可控制的腫瘤，故在臨床上要運用恰當，如何調節臍血干細胞量化分離純化，擴增和貯存，調控細胞和宿主之間特定細胞分化而不過度增殖也是研究重點[10]。另外有學者稱，臍血干細胞能促進GDNF在損傷脊髓中局部表達，在損傷局部能分泌突膠質細胞分泌的BDNFNT-3，故能提高神經功能。

[1]唐映，楊萬章，胡國恒，等.臍血干細胞移植治療腦卒中的研究現狀[J].中國組織工程研究與臨床康復，2013，11(46)：9 361-9 364.

[2]潘鳳華，李曉波，丁新生，等.人臍血干細胞移植治療大鼠腦缺血的實驗研究[J].臨床神經病學雜志，2012，19(2)：121-123.

[3]潘鳳華.人胚神經干細胞及人臍血干細胞移植治療大鼠腦缺血的實驗研究[D].南京：南京醫科大學，2012.

[4]王清勇，楊松林，朱德茂，等.臍血間充質干細胞移植對腦梗死大鼠腦內NGF、BDNF表達的影響[J].中國誤診學雜志，2012，12(16)：4 122-4 124.

[5]劉海英，李建峰，李洪均，等.人臍血CD34+細胞移植對局灶性腦缺血大鼠神經功能恢復的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2013，12(3)：451-455.

[6]Seghatoleslam M，Jalali M，Nikravesh MR，et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood-mononuclear cells dose-dependently relieve neurologic deficits in rat intracerebral hemorrhage model[J].Ann Anat，2013，195(1)：39-49.

[7]丁潔，程焱.臍血間充質干細胞及其在腦梗死治療中的作用[J].國際腦血管病雜志，2012，15(8)：607-611.

[8]馬建華，吳月奎，易波，等.臍血源神經干細胞移植改善局灶性腦缺血大鼠神經功能障礙[J].中華神經醫學雜志，2014，13(4)：353-357.

[9]歐雅莉，余國龍.經體循環臍血細胞移植治療腦梗死機制及其療效影響因素[J].心血管病學進展，2012，31(5)：733-735.

[10]劉劍宇.銀杏達莫聯合臍血間充質干細胞移植治療大鼠腦梗死[J].醫學信息，2013，26(4)：234-235.

(收稿2015-08-10)

張媚，E-mail：420663068@qq.com

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1673-5110(2016)17-0021-03