地塞米松對結核性腦膜炎患者單核細胞TLR4 MyD88表達的影響

周　杰　王　敬　馮　薇

重慶三峽中心醫院神經內科　重慶　404000

?

·論著·

地塞米松對結核性腦膜炎患者單核細胞TLR4 MyD88表達的影響

周杰王敬馮薇

重慶三峽中心醫院神經內科重慶404000

目的分析地塞米松治療結核性腦膜炎患者的臨床療效及對單核細胞TLR4、MyD88表達的影響。方法60例結核性腦膜炎患者分為觀察組和對照組，觀察組36例給予常規抗結核聯合地塞米松治療，對照組僅給予抗結核治療，分析臨床療效及2組患者外周血單核細胞TLR4、MyD88的表達。結果聯合治療組總有效率為91.67%，顯著優于對照組(χ2=5.17，P<0.05)；地塞米松治療能夠顯著降低TLR4、MyD88的表達水平。結論抗結核治療聯合地塞米松能顯著提高治療有效率，TLR4-MyD88通路在地塞米松治療結核性腦膜炎過程中有重要作用。

地塞米松；結核性腦膜炎；單核細胞；TLR4；MyD88

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是結核分枝桿菌經血行或其他途徑傳播到蛛網膜下腔，累及脊髓膜和腦膜的一種非化膿性炎性疾病，具有極高的致死率和致殘率[1]。近年耐藥株的增加及AIDS流行等導致TBM發病率呈上升趨勢，嚴重威脅患者的生命健康，早期診斷并給予積極治療是良好預后、預防并發癥的前提條件。Toll樣受體是固有免疫中一種重要的識別受體，其中TLR4分布于抗原提呈細胞，TLR4可以通過下游MyD88依賴途徑進行信號傳導，促進炎性細胞因子的分泌[2]。地塞米松對免疫應答起雙向調節作用，可以誘導靜息狀態下T細胞表達TLR4，卻抑制活化T細胞TLR4的表達[3]。本研究基于TLR4/MyD88信號通路探討地塞米松減輕結核性腦膜炎患者過度免疫反應的可能機制，為臨床提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013-07—2015-04我院神經內科住院治療并經改良抗酸法確診的60例結核性腦膜炎患者為研究對象，觀察組采用常規抗結核聯合地塞米松(西南藥業，國藥準字H50021462，1 mL：5 mg)治療，對照組采用常規抗結核治療，2組患者均簽署知情同意書，在年齡、病程等方面差異無統計學意義(P>0.05)，有可比性。

1.2治療方法對照組給予抗結核治療，包括抗結核化治療，降低顱內壓，腦水腫等，利福平1.45～0.6 g/d，異煙肼0.6 g/d，乙胺丁醇 0.75 g/d，吡嗪酰胺 1.0～1.5 g/d，3個月強化治療后給予12個月鞏固治療，口服1次/d；根據患者的體質量予以20%甘露醇進行治療，于1 h內靜滴完畢。觀察組在對照組治療的基礎上給予地塞米松10 mg/d靜滴。

1.3檢測指標與方法外周血單核細胞分離：在抗結核治療前、抗結核治療1周、抗結核治療2周3個時間點采集肘靜脈血5 mL，加入肝素抗凝管并混勻，采用HISTOPAQUE-1077淋巴細胞分離液(Gibco-BRL公司)分離外周血單核細胞，操作參照試劑說明書。RT-PCR檢測外周血單核細胞中TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達水平：按照Trizol Reagent(上海生工生物公司)試劑盒說明書提取外周血單核細胞總RNA，并應用隨機引物和反轉錄酶試劑盒(Superscript Ⅱ)反轉錄合成cDNA第一鏈，然后以RT-PCR檢測TLR4 mRNA及MyD 88 mRNA表達水平，采用GAPDH基因作為內參。目的基因相對表達量=2-△△CT。Western Blot檢測外周血單核細胞中TLR4及MyD88表達水平：將收集的單核細胞加入200 μL細胞裂解液(50 mM Tris-Hcl pH 8.0，150 mM PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制劑)。4 ℃12 000 r/min離心15 min，取上清，采用Bradford法檢測蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50 μg上樣到15% SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉至NC膜，用5%脫酯奶粉封閉，分別加一抗(美國sigma公司)，37 ℃孵育2 h，經0.1%TBST漂洗后加二抗(1：2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X光膠片定影，掃描后用IPP 6.0進行圖像分析。

1.4療效標準臨床療效判斷：顯效：體溫恢復正常、癥狀緩解，意識清晰，腦脊液常規及生化指標顯著改善；有效：體溫正常，癥狀部分緩解，腦脊液常規及生化指標好轉；無效：上述各指標、癥狀無改善或惡化；死亡。

2　結果

2.12組臨床療效比較觀察組顯效23例，有效10例，總有效率91.67%，顯著優于對照組(χ2=5.17，P<0.05)。見表1。

2.22組外周血單核細胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達比較采用RT-PCR對2組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達水平進行分析，結果顯示觀察組外周血單核細胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表1　2組臨床療效比較　(n)

表2　2組外周血單核細胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表達分析

注：與對照組比，*P<0.05

2.32組外周血單核細胞TLR4及MyD88表達比較采用Western Blot對2組患者外周血單核細胞TLR4及MyD88表達水平進行分析，結果顯示觀察組患者外周血單核細胞TLR4及MyD88表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。見表3、圖1。

表3　2組外周血單核細胞TLR4及MyD88表達比較

注：與對照組比，*P<0.05

圖1　2組TLR4及MyD88表達

3　討論

結核性腦膜炎是全球范圍內公共衛生領域的一個難題，尤其在落后的國家和地區，流行病學研究顯示1/3的TBM患者死亡，在合并HIV感染患者中病死率更高[4]。部分患者會留下如腦梗死、腦積水、顱內神經損害等嚴重的中樞神經系統后遺癥。早期診斷和及時對癥治療對結核性腦膜炎患者預后至關重要。目前對于結核性腦膜炎的治療包括對癥支持、抗結核藥物治療及預防并發癥等[5]。早期、足量、聯合及全程用藥是抗結核藥物的應用原則，及早應用皮質激素治療能夠降低顱內壓，減輕腦水腫，抑制纖維化防止粘連，減輕中毒癥狀。劉海梅等[6]研究顯示，在常規抗結核治療的基礎上給予鞘內給藥加腦脊液置換治療臨床治愈率和有效率明顯提高，患者腦脊液壓力及各項生化指標恢復時間顯著提前。尹忠平等[7]在常規抗結核治療基礎上給予地塞米松沖擊治療能夠在不增加不良反應的同時顯著提高臨床療效，縮短治療時間。地塞米松是強效的抗炎物質，作為主要的免疫調節劑一直應用至今，能影響炎性級聯的多重通路，對免疫應答反應起雙向調節作用。由于使用地塞米松有導致結核擴散的風險，因此在嚴重的結核感染患者中忌用。

當結核分枝桿菌通過呼吸道傳播途徑進入宿主肺泡巨噬細胞后，細菌開始復制并擴散進入區域淋巴循環系統，在獲得性免疫反應啟動之前，細菌可通過血液傳播散播到身體其他器官，引起TBM等肺外結核的發生。該過程受到機體固有免疫反應性質和程度的影響，Toll樣受體為跨膜信號傳導受體，通過對病原微生物表面高度保守的結構PAMPs的識別發揮作用[8]，通過激活一系列信號級聯反應誘導細胞因子和炎癥因子的產生，在結核分枝桿菌感染中發揮重要的作用。體外研究證實，地塞米松能夠抑制LPS刺激TLR4的表達[9]，而TLR4的活化減少會調節下游MyD88的表達，抑制炎癥反應[10]。因此本研究基于TLR4-MyD88信號途徑探討地塞米松治療結核性腦膜炎的作用機制，研究顯示，與對照組比，常規抗結核治療聯合地塞米松能夠顯著提高結核性腦膜炎的有效率，且能夠抑制患者外周血單核細胞中TLR4及MyD88的表達，提示TLR4/MyD88信號通路可能在結核性腦膜炎的發生發展及地塞米松的作用過程中有重要的作用。

[1]湯海燕，談鷹，張栗，等.腦脊液與血漿生化指標比值對結核性腦膜炎與化膿性腦膜炎的鑒別意義[J].中國全科醫學，2015，18(14)：1 705-1 707；1 710.

[2]趙乃倩，王冬青，榮青峰，等.軟脂酸增加血管內皮細胞Toll樣受體4表達及活化TLR4炎癥信號通路[J].南方醫科大學學報，2013，33(12)：1 775-1 777；1 800.

[3]王志，計國義，李揚，等.地塞米松對內毒素休克大鼠腦皮質TLR4、IκBα和IL-18 mRNA表達的影響[J].吉林大學學報：醫學版，2007，33(5)：841-844.

[4]毛霖，雷素云，楊欣平，等.126例HIV/AIDS合并結核病臨床分析[J].中國老年保健醫學，2015，13(2)：47-48；49.

[5]閔麗，熊小平，王榮耀，等.腦脊液置換加鞘內給藥治療結核性腦膜炎的臨床療效評價[J].中國藥業，2013，22(15)：35-36.

[6]劉海梅，韓麗，張成輝，等.鞘內給藥加腦脊液置換治療結核性腦膜炎的臨床分析[J].中國醫藥導刊，2015，17(2)：125-126；129.

[7]尹忠平，鄧雷梅，羅昌菊，等.結核性腦膜炎患者地塞米松沖擊治療的臨床研究[J].中華醫院感染學雜志，2014，24(15)：3 736-3 738.

[8]Thapa S，Nagy E，Abdul-Careem MF.In ovo delivery of Toll-like receptor 2 ligand，lipoteichoic acid induces pro-inflammatory mediators reducing post-hatch infectious laryngotracheitis virus infection[J].Vet Immunol Immunopathol，2015，164(3/4)：170-8.

[9]Bonin CP，Baccarin RY，Nostell K，et al.Lipopolysaccharide-induced inhibition of transcription of tlr4 in vitro is reversed by dexamethasone and correlates with presence of conserved NFκB binding sites[J].Biochem Biophys Res Commun，2013，432(2)：256-261.

[10]Ding Y，Yang H，Xiang W，et al.CD200R1 agonist attenuates LPS-induced inflammatory response in human renal proximal tubular epithelial cells by regulating TLR4-MyD88-TAK1-mediated NF-κB and MAPK pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，460(2)：287-294.

(收稿2015-09-17)

Effects of dexamethasone on the expressions of TLR4 and MyD88 in peripheral blood monocytes in tuberculous meningitis patients

ZhouJie，WangJing，FengWei

DepartmentofNeurology，theCentralHospitalofThreeGorges，Chongqing404000，China

ObjectiveTo analyze the effects of dexamethasone on the expressions of TLR4 and MyD88 in peripheral blood monocytes in tuberculous meningitis patients.MethodsSixty cases with tuberculous meningitis were divided into observation group and control group，and 36 cases in the observation group were treated with conventional anti-TB therapy in combination with dexamethasone，the control group only received anti-TB treatment.Then clinical efficacy and the expressions of TLR4 as well as MyD88 in peripheral blood monocytes were analyzed.ResultsTotal effective rate in the observation group was 91.67%，and was significantly better than that in the control group (χ2=5.17，P<0.05)；Dexamethasone treatment could significantly reduce the levels of TLR4 and MyD88 expressions.ConclusionsAnti-TB therapy plus dexamethasone can significantly improve clinical efficacy.And dexamethasone via TLR4-MyD88 pathway may play an important role in tuberculous meningitis.

Dexamethasone；Tuberculous meningitis；Monocytes；TLR4；MyD88

重慶市衛生局醫學科研項目，編號：2013-2-172

R529.3

A

1673-5110(2016)17-0001-02