重組人腦利鈉肽對阿霉素小鼠急性心肌損傷時氧化應激和炎癥因子的影響

袁李禮，蔣　宇

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重組人腦利鈉肽對阿霉素小鼠急性心肌損傷時氧化應激和炎癥因子的影響

袁李禮1，蔣宇2

目的探討重組人腦利鈉肽對阿霉素所致小鼠急性心肌損傷時氧化應激水平和炎癥因子表達的影響。方法將50只昆明小鼠隨機分為正常對照組(10只)、阿霉素組(20只)和rhBNP治療組(20只)。正常對照組不做任何處理；阿霉素組單次腹腔注射阿霉素15 mg/kg；rhBNP治療組單次腹腔注射阿霉素15 mg/kg，每間隔12 h給予新活素注射液50 μg/kg。觀察48 h后小鼠心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、白細胞介素6(IL-6)mRNA表達，以及肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、血清SOD、丙二醛(MDA)和IL-6水平變化。結果阿霉素處理后小鼠產生急性心肌損傷表現，心肌酶學指標(CK-MB、LDH)升高(P<0.05)。與阿霉素組相比，rhBNP治療組的肌酶學指標(CK-MB、LDH)降低，心肌組織中SODmRNA表達升高，IL-6 mRNA表達降低，血清SOD活性升高，MDA含量降低，IL-6水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。 結論rhBNP注射液能夠通過提高抗氧化酶活性，降低脂質過氧化，減輕炎癥因子，從而減輕阿霉素所致的小鼠急性心肌損傷。

急性心肌損傷；重組人腦利鈉肽；阿霉素；氧化應激；炎癥

阿霉素是一種蒽環類廣譜抗腫瘤藥物，臨床上常用于治療惡性實體瘤及血液系統腫瘤。但其劑量依賴性心肌毒性作用限制了它的廣泛應用，主要表現為不可逆的心肌損傷，最終演變成充血性心力衰竭[1]。重組人腦利鈉肽(rhBNP)是一種人工合成的B型腦利鈉肽，與BNP有著相同的生物學作用。大量研究表明[2-3]：rhBNP治療心力衰竭取得了良好的臨床治療效果，已經被列入美國、歐洲以及中國心力衰竭的治療指南[4-6]，但其是否能作為有效的藥物對抗阿霉素所引起的急性心肌損傷尚不明確。本研究觀察rhBNP對阿霉素所致的急性心肌損傷的影響，并進一步探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級8周齡雄性昆明小鼠50只，體重35 g±3 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2主要實驗藥物和試劑阿霉素購自美國Sigma公司；rhBNP(新活素，凍干重組人腦利鈉肽)購自成都諾迪康生物制藥有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素6(IL-6)ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德有限公司；肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)采用Olympus全自動生化分析儀檢測；RNA提取試劑RNAiso Plus、逆轉錄試劑PrimeScriptTMRT reagent Kit和實時定量PCR試劑SYBR? Premix Ex Taq購自大連Takara公司，引物序列由上海生工公司合成。

1.3動物模型及分組SFP級8周齡雄性昆明小鼠50只，隨機分為3組。正常對照組(Control組)10只，不做任何處理；②阿霉素組(ADR組)20只，單次腹腔注射阿霉素15 mg/kg，每間隔12 h給予生理鹽水0.5 mL。rhBNP治療組(rhBNP組)20只，單次腹腔注射阿霉素15 mg/kg，每間隔12 h給予新活素注射液0.5 mL(50 μg/kg)。

1.4標本收集小鼠在阿霉素處理后48 h，腹腔注射5%的水合氯醛麻醉，心臟穿刺采血，2 000 r/min離心15 min收集血清，用于心肌酶學、氧化應激及炎癥因子指標研究。提取心肌組織總RNA用于mRNA表達分析。

1.5觀察指標血清心肌酶學指標測定：取0.2 mL血清于全自動生化分析儀檢測CK-MB和LDH水平。

1.5.1mRNA表達利用RNAiso Plus提取心肌組織總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit將總RNA逆轉成cDNA，通過SYBR?Premix Ex Taq進行real-time PCR檢測，具體步驟按說明書操作。SOD、IL-6和GAPDH引物序列見表1。

表1　引物序列

1.5.2血清氧化應激及炎癥因子指標測定黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD水平，硫代巴比妥酸法測定血清MDA水平，ELISA法測定血清IL-6水平，具體步驟按說明書操作。

2　結　果

2.13組小鼠血清心肌酶學指標比較阿霉素處理后小鼠出現心肌損傷，表現為心肌酶學指標CK-MB和LDH水平升高(P<0.05)，rhBNP組小鼠CK-MB和LDH水平較ADR組降低(P<0.05)。詳見表2。

表2　各組血清心肌酶學指標比較(±s) 　U/L

2.23組小鼠心肌組織SOD和IL-6 mRNA水平比較阿霉素處理后小鼠心肌組織SOD mRNA水平降低(P<0.05)，IL-6 mRNA水平升高(P<0.05)，rhBNP組小鼠心肌組織SOD mRNA水平較ADR組升高(P<0.05)，但仍低于Control組(P<0.05)；而rhBNP組小鼠心肌組織IL-6 mRNA水平較ADR組降低(P<0.05)，但仍高于Control組(P<0.05)。詳見圖1。

注：與Control組相比，*P<0.05；與ADR組相比，#P<0.05。

2.33組小鼠血清氧化應激和炎癥因子指標比較(見表3)阿霉素處理后小鼠血清SOD活性降低、MDA和IL-6的含量升高(P<0.05)，rhBNP治療能提高SOD活性，降低MDA和IL-6的含量(P<0.05)，但不能恢復到正常小鼠水平(P<0.05)。

表3　各組小鼠血清氧化應激和炎癥因子指標比較(±s)

3　討　論

阿霉素是一種目前臨床廣泛應用并有效的蒽環類抗腫瘤藥物，其抗腫瘤譜包括肺癌、乳腺癌、淋巴瘤等。但由于其劑量依賴性心肌毒性作用，嚴重的限制了臨床應用的劑量與療程。對于一些伴有慢性基礎疾病的高齡病人，阿霉素的心肌毒性尤為敏感。阿霉素的心肌毒性表現為急性和慢性兩種，急性心肌毒性表現為心肌損傷、心律失常和心力衰竭；慢性表現為慢性充血性心力衰竭。阿霉素的心肌損傷多為不可逆的，且預后極差。因此，尋找阿霉素的心肌保護性藥物是一個有待解決的問題。

阿霉素導致心肌毒性的機制尚不完全明確，其中比較公認的是氧自由基學說。阿霉素和心肌組織的親和力高，且其化學結構在代謝過程中易產生活性氧[7]。阿霉素會被內皮型一氧化氮合酶還原酶還原成半醌類中間產物，誘發活性氧產生，同時阿霉素能損傷線粒體DNA干擾呼吸鏈功能，釋放更多的氧自由基[8]，此外，阿霉素能降低體內SOD等酶的活性，使氧自由基的清除受損。多因素下導致的氧自由基堆積，引起脂質過氧化，損傷細胞膜及細胞器膜，導致鈣平衡紊亂、核酸蛋白合成抑制，從而影響心肌的舒縮功能。近年來，炎癥反應在阿霉素心肌毒性中的作用日益受到關注。阿霉素能誘導炎癥反應，導致多種炎癥因子分泌的增加，包括白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6、白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和核轉錄因子(NF-κB)等[9-11]。此外有研究報道白細胞介素1(IL-1)受體拮抗劑預處理能夠降低阿霉素所致的小鼠死亡，減輕心肌損傷[12]。

重組人腦利鈉肽是利用基因生物工程技術人工合成的B型腦利鈉肽。其與BNP具有相同的氨基酸序列、空間結構以及生物學功能，在心血管疾病治療方面具有多重作用。主要包括：①與利鈉肽結合，激活環磷酸鳥苷(cGMP)依賴的信號級聯[13]；②擴張靜脈、動脈和冠脈，降低心臟前后負荷[14]；③增加腎小球濾過率，抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統，利鈉排尿[14]。

本研究觀察小鼠心肌酶學改變、心肌組織SOD和IL-6 mRNA表達，以及血清SOD、MDA和IL-6水平變化，探討rhBNP對阿霉素所致的小鼠急性心肌損傷的影響及可能機制。結果顯示，小鼠在阿霉素注射后產生急性心肌損傷，表現為心肌酶學指標CK-MB和LDH水平升高，rhBNP治療后心肌酶學指標明顯下降。在氧化應激方面，阿霉素注射后小鼠心肌組織中SOD mRNA降低，血清SOD活性降低、MDA含量升高，rhBNP治療能夠升高SOD mRNA表達，提高血清SOD活性以及降低血清MDA含量。在炎癥因子方面，阿霉素注射后小鼠心肌組織中IL-6 mRNA升高，血清IL-6分泌增加，rhBNP治療能夠抑制IL-6 mRNA表達和血清IL-6分泌。rhBNP治療后能在一定程度上改善阿霉素所引起的小鼠心肌損傷、氧化應激及炎癥反應。

本研究結果提示：rhBNP能夠減輕阿霉素所致的急性心肌損傷，其具體機制可能是：①通過提高SOD表達和活性，對抗阿霉素所致的自由基堆積，減輕脂質過氧化，保護心肌細胞從而改善心肌舒縮功能；②通過降低心肌組織炎癥反應，減輕炎癥因子對心肌細胞的損傷，從而對抗阿霉素所致的心肌損傷。rhBNP通過以上機制起到對阿霉素所致的心肌損傷的保護，對于預防其化療時心肌毒性、更好地發揮其抗腫瘤效果有著重要的意義。

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(本文編輯郭懷印)

1.湖南省第二人民醫院(長沙 410007)；2.湖南省人民醫院急救醫學研究所

蔣宇，E-mail：jiangyu146@hotmail.com

R542.2R256.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．16．010

1672-1349(2016)16-1859-03

2015-12-03)