高原多臟器功能障礙綜合征蕨麻小型豬模型的建立及促腎上腺皮質激素與皮質酮的變化

馮小明, 羅曉紅, 王紅義, 郭曉宇, 陸 璐, 申　健, 肖　攀, 牛廷獻（蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科, 蘭州 730050）

高原多臟器功能障礙綜合征蕨麻小型豬模型的建立及促腎上腺皮質激素與皮質酮的變化

馮小明, 羅曉紅, 王紅義, 郭曉宇, 陸 璐, 申健, 肖攀, 牛廷獻
（蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科, 蘭州 730050）

目的 研究高原多臟器功能障礙綜合征（H-MODS）蕨麻小型豬模型的建立及促腎上腺皮質激素（ACTH）與皮質酮（CORT）的變化特點。方法 選用3個劑量（低、中、高）內毒素（LPS）誘導高原土生蕨麻小型豬成功建立H-MODS模型（B、C、D組），生理鹽水為對照組（A組）。檢測不同時點血清生理生化指標及ACTH與CORT表達水平。 結果各組蕨麻小型豬泵入LPS后肌酸激酶（CK）在3～24 h升高，48 h之后明顯降低； 天門冬氨酸轉氨酶（AST）在6～24 h升高； 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）在12 ～24 h的水平顯著高于0 h和A組； 總膽紅素（TBIL）在24～48 h的水平顯著升高； 肌酐（CRE）在6 h水平明顯高于0 h。白細胞數量在0～6 h升高，6～24 h降低。ACTH表達量在泵入LPS后開始上升, 在12 h后降低，在72 h基本恢復到與對照組相同水平； CORT在泵入LPS后3 h上升至最高，后又開始下降，24 h后開始上升，在72 h時基本恢復到正常。低、中、高劑量組的變化趨勢基本相同。結論高原MODS形成時機體處于嚴重感染應激狀態下，ACTH與CORT表達水平出現劇烈變化, 下丘腦-垂體-腎上腺軸對機體調節的動態平衡被打破而出現紊亂。

高原多臟器功能障礙綜合征（H-MODS）； 蕨麻小型豬； 促腎上腺皮質激素（ACTH）；皮質酮（CORT）

我國高原地區面積大, 急性重型高原病并發多臟器功能障礙綜合征（highland multiple organ dysfunction syndrome, H-MODS）的發病率較高［1,2］。本質上, H-MODS與平原MODS沒有差別，但高原特殊的缺氧環境使其所受外界環境的影響因素有所不同, 所以其臨床特征及發病特點也會出現一些變化［3］。下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸作為神經內分泌免疫網絡的樞紐, 主要作用是維持人體內環境的穩定, 對外界環境的刺激做出生理心理反應，以適應環境的刺激。本研究在海拔3 200 m的高原實地采用高原土生動物蕨麻小型豬作為研究對象建立H-MODS模型, 對其血液生理生化指標進行檢測, 并對促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質酮（CORT）的表達量進行檢測,研究H-MODS發生發展中神經內分泌的變化特點。

1　材料與方法

1.1動物與試劑

蕨麻小型豬24只，雌雄各半，體質量15 kg左右，分為H-MODS蕨麻小型豬模型高、中、低劑量組和對照組，每組6只，按雌雄各半隨機分組。蕨麻小型豬為甘南地區散戶飼養。ACTH、CORT試劑盒均購自Cusabio公司（美國）。氯胺酮（國藥準字： H35020148，福建古田藥業有限公司），地西泮注射液（國藥準字： H12020957, 天津金耀氨基酸有限公司），內毒素（LPS） （血清型為： O127： B8，批號為64H4010，Sigma公司，美國）。

1.2模型建立

建模方法參照文獻［4］，本實驗在海拔3 500 m的甘南?？撇菰M行，將豬運到在實驗地點適應性飼養3 d，待動物狀態穩定后進行實驗。采用氯胺酮（6 mg/kg）聯合安定（0.5 mg/kg）進行肌肉注射麻醉動物，同時肌肉注射阿托品（0.05 mg/kg）。動物麻醉后經耳緣靜脈泵入LPS，每組泵入時間均控制在30 min左右, 低、中、高劑量組分別按0.25 mg/kg B組）、0.35 mg/kg（C組）、0.5 mg/kg（D組），對照組（A組）以等量的生理鹽水代替。

1.3MODS的診斷標準

參照胡森等［5］提出的動物發生MODS時各個器官功能障礙分期診斷標準和評分標準。在注射LPS后出現2個或2個以上器官或系統功能障礙判定為MODS。

1.4血清采集

三組分別于泵入LPS后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h經頸靜脈采血, 分離血清存于-80 ℃備用。

1.5血常規及血清生化指標的測定

血常規測定白細胞數（WBC），血清生化指標檢測［6］肌酸激酶（CK）、天門冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）和肌酐CRE）。血常規及各項生化指標的檢測均由本院檢驗科完成。

1.6ELISA檢測指標

ACTH與CORT表達水平的檢測由本實驗室按試劑盒操作說明操作完成。

1.7 數據處理與統計

2　結果

2.1體征表現

泵入LPS 1 h后低、中劑量組豬開始轉醒但是倒臥不起，高劑量組仍然昏睡，各組豬均出現心率增快，伴隨有腹脹、發熱、尿頻； 蘇醒后四肢無力倒臥，無食欲，精神萎靡，呼吸急促； 高劑量組在2 h后開始轉醒；低、中劑量組豬在8 h后站立行走，開始采食，精神基本恢復正常，高劑量組晚2 h恢復； 中劑量組1頭豬在4 h時因呼吸窘迫、心律失常、繼之心衰死亡。高劑量組豬在3 h和5 h時各有1只豬因呼吸窘迫、心律失常、繼之心衰死亡。低劑量組豬沒有出現死亡，對照組豬體征表現正常也沒有出現死亡。中劑量組與高劑量組豬死亡率分別為16.7%和33.3%。

2.2血清生化指標的變化

B、C、D組CK在3～24 h的水平與0 h和A組相比有明顯的升高，但是在48 h之后明顯降低，其水平低于0 h和A組。B、C、D組AST 在6～12 h水平與0 h和A組相比顯著升高，且在12 h升至最高。B、C、D組ALT在12～24 h水平顯著高于0 h和A組（P＜0.01或P＜0.05）。B、C、D組TBIL在24～48 h水平顯著高于0 h和A組, B組在72 h的水平顯著高于0 h和A組（P＜0.01或P＜0.05）。C、D組CRE在6 h水平均明顯高于0 h （P＜0.05）（表1）。

2.3WBC、ACTH與CORT的變化

靜脈泵入LPS后，B、C、D組WBC數目急劇下降，在3～6 h與0 h和A組相比明顯下降（P＜0.05 或P＜0.01），在6 h之后開始攀升，24 h時B、C、D組WBC 與0 h和A組相比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），C、D組在 48 h時與0 h和A組相比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），D組在 48 h時達到最高點，B、C組在24 h上升至最高點，B、C、D組WBC數目在72 h變化基本恢復到正常。從總體變化趨勢來看，D組較B、C組WBC數目升降變化幅度大（表2）。

B、C、D組在注入LPS后，ACTH表達量開始上升， D組在3 h時與0 h和A組相比明顯升高，C組和A組相比明顯升高（P＜0.05）； B組在6 h時與A組相比明顯升高，C、D組0 h和A組相比明顯升高（P＜0.05），詳見表2。CORT在注入LPS后同樣開始上升，在3 h、6 h D組與0 h和A組相比明顯升高（P＜0.05）； 12 h 時C組與0 h和A組相比明顯降低（P＜0.05）（表2）。

3　討論

本研究采用LPS誘導蕨麻小型豬多臟器損傷建立H-MODS模型，選用高、中、低3個劑量來建立模型，結果表明3個劑量的LPS都可以引起蕨麻小型豬生理生化指標的變化，同時中、高劑量組豬均出現死亡，都可以成功建立H-MODS模型。

本研究在成功建立H-MODS模型的基礎上，進一步對動物發生MODS時的HPA軸神經內分泌進行檢測，研究H-MODS發生發展中神經內分泌的變化特點。一般而言，動物會根據外界環境的刺激作出生理心理反應以適應環境的刺激。在應激狀態下HPA軸會導致腎上腺分泌糖皮質激素（GC），然后與其受體結合產生負反饋調節作用而形成調控作用［7］，糖皮質激素伴隨應激的結束而恢復到正常水平，通過這種機制可以維持機體內環境的穩定，HPA軸在整個應激反應過程中起到平衡激素水平和應對應激的作用。

表1　LPS靜脈注射后小型豬血清生化指標的變化Table 1　The change of biochemical indexes in serum of minipigs after injecting LPS

表2　各組小型豬不同時點WBC、ACTH與CORT的比較Table 2　The comparison of number WBC，ACTH and CORT in different time in each group of minipigs

ACTH與CORT是表征HPA神經內分泌的兩個重要指標。ACTH是維持腎上腺正常形態和功能的重要激素, 動物處于正常的生理狀態下, 腎上腺對垂體和下丘腦通過分泌的GC形成負反饋作用, ACTH也可負反饋作用于下丘腦, 形成一個相互協調的反饋調節系統, 但是機體處于急性或長期的慢性應激刺激下, HPA會出現一些病理變化而表現異常［8］, 這時機體將可能出現一系列功能紊亂。因此, 高原MODS發生時, 動物在LPS的急性應激和高原環境的持續刺激下, ACTH開始升高, 至24 h后開始回落, HPA 軸在這種應激狀態下, 持續亢進, 一方面, 機體的一些功能出現失調或者紊亂狀態； 另一方面, HPA 軸也在刺激中調整應對, 逐漸顯示機體的自我調節功能, 在48 h后, ACTH開始回落恢復到正常范圍。

CORT是通過腎上腺皮質線粒體中的11 β-羥化酶的作用，由11-脫氧皮質醇生成［9］。動物處于應激狀態下，各種有關應激的輸入信息聚集于一些小細胞性神經元，這些神經元會合成促糖皮質激素釋放激素（CRH）和精氨酸加壓素 （AVP），同時，下丘腦室旁核也產生CRH，CRH通過垂體門脈系統進入垂體前葉，刺激ACTH的釋放，ACTH作用于腎上腺皮質，促進一個完整的HPA 軸系統，最終發揮生物學作用。因此，高原MODS發生時，動物在LPS的急性應激和高原環境的持續刺激下，HPA 軸的會出現異常， CORT開始升高之后又降低。這可能是機體在應激狀態下，HPA軸持續亢進，超過了其自身調節的范圍，從而引起機體出現神經、免疫、內分泌等多系統功能紊亂的各種癥狀［10,11］。

有研究［12］表明，應激HPA軸亢奮狀態下應激激素上升導致小膠質細胞活化［13,14］，產生如腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細胞介素-1β （IL-1β）、一氧化氮（NO）、前列腺素和活性氧等一系列炎性因子以及趨化因子［15］，這些物質均能加重中樞神經系統的炎癥反應，使HPA 軸調節失衡，導致應激刺激及炎癥更加嚴重。此外，先前研究［16,17］表明，MODS形成時TNF-α與IL-1β炎癥因子表達量也出現上調，本研究中ACTH與CORT表達量也開始升高，HPA 軸活動增強，HPA 軸平衡被打破。有研究［18］證實，手術創傷引起的應激可導致HPA 活動增強，血液中CORT的水平顯著提高。此外，有研究［19］顯示，肝氣郁結實驗模型組血漿ACTH、CORT含量高于對照組，HPA 軸興奮性升高。也有研究［20］報道長期慢性束縛應激會造成大鼠血漿CORT和ACTH含量的升高，內分泌功能失調，HPA軸功能亢進。本研究中高劑量LPS組出現動物的高死亡率，CORT和ACTH表達量也比低劑量組高，機體平衡失調嚴重程度不同，其死亡率也不同，這與上述研究報道的結果也是相符的。

可見，動物在泵入LPS之后形成H-MODS時，機體處于嚴重的應激感染狀態下，HPA軸開始對動物進行調節，而HPA軸的調節是一種動態的調節，炎癥反應使得HPA軸的調節狀態出現紊亂，調節的動態平衡被打破； 同時，伴隨著HPA軸平衡被應激炎癥反應打破，HPA軸開始進行調節，抑制過度炎癥反應，維持機體的平衡。因此，HPA軸的調節作用具有雙重性。大量研究證實，感染應激時給予補充外源性糖皮質激素可減輕感染的嚴重程度，降低死亡率。相反，如果切斷機體內源性糖皮質激素來源或使用糖皮質激素受體抑制劑往往增加感染的死亡率［21-23］。而另一方面，如果HPA軸過度激活有加重機體感染的危險。因此，研究H-MODS發生發展過程HPA軸變化特點，將有助于加強對H-MODS本質的認識，對H-MODS的干預治療提供理論參考。

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Establishment of Highland Multiple Organ Dysfunction Syndrome Model in Juema Minipig and Changes of Adrenocorticotropic Hormone and Corticosterone

FENG Xiao-ming, LUO Xiao-hong, WANG Hong-yi, GUO Xiao-yu, LU Lu, SHEN Jian, XIAO Pan, NIU Ting-xian
（Lanzhou General Hospital， Lanzhou Military CommandDepartment of Animal Experiment， Lanzhou 730050， China）

ObjectiveTo study the expression changes of adrenocorticotropic hormone （ACTH） and corticosterone （CORT） by model of the highland multiple organ dysfunction syndrome （H-MODS） in Juema minipig. MethodsThe H-MODS model was induced by different dosages of lipopolysaccharide （LPS） in Juema minpig （groups B, C and D）, the saline as the control. The expression of CORT and ACTH in serum at different times were detected. ResultsThe expression of ACTH in model groups were rised after pumping LPS and reduce after 12 h, and to return the same as the control in the 72 h. The expression of CORT was rised to highest at 3 h after pumping LPS and then to decline, but to rise after 24 h, and to return the same as the control in the 72 h. The changes in groups of B, C and D have the same trendency. ConclusionThe H-MODS has the severe infection in the model minipigs, the expressionof CORT and ACTH have significient changes, andthe regulation balance of hypothalamicpituitary-adrenal axis was broken.

Highland multiple organ dysfunction syndrome（H-MODS）； Juema minipig；Adrenocorticotropic hormone （ACTH）； Corticosterone （CORT）

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0107-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.005

2015-09-21

甘肅省技術研究與開發專項計劃（1205TCYA010）

馮小明（1980-）, 男, 主管技師, 主要研究方向： 實驗動物質量控制及開發。E-mail： fxm8006@163.com

牛廷獻（1966-）, 男, 主任技師, 主要研究方向： 人類疾病動物模型的建立及相關研究。E-mail： niutx10000@163.com