紅花刺槐花粉生活力測定及保存方法

李 娟，姚硯武

(1.河北省滄州市鹽山縣農林局，河北滄州 061300；2.北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093)

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紅花刺槐花粉生活力測定及保存方法

李 娟1，姚硯武2*

(1.河北省滄州市鹽山縣農林局，河北滄州 061300；2.北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093)

[目的]研究紅花刺槐花粉活力的測定及保存方法，為紅花刺槐的人工雜交授粉提供參考依據。[方法]利用離體培養法、TTC法、I2-KI法測定花粉生活力，同時研究不同保存方法對紅花刺槐花粉萌發的影響。[結果]紅花刺槐花粉在蔗糖20.0 mg/L+硼酸2.0 mg/L的培養基中萌發率最高(29.56%)；I2-KI法不適用于紅花刺槐花粉活力的測定，TTC法的測定效果仍有待進一步檢驗；低溫比常溫更適于紅花刺槐花粉的保存，花粉在0 ℃保存15 d后，萌發率仍達17.67%。[結論]蔗糖20.0 mg/L+硼酸2.0 mg/L為紅花刺槐最適培養基組合，低溫更適合紅花刺槐花粉的保存。

紅花刺槐；花粉活力；保存條件

紅花刺槐(Robiniahisqida)為種間雜種(R.viscose×R.pseudoacacia)，商業上常被稱為無刺槐，刺比普通刺槐稍小，屬蝶形花科刺槐屬落葉喬木[1]。紅花刺槐因其花色鮮艷常作為一般觀賞型植物引種[2]，同時紅花刺槐還是優良的蜜源樹種[3]，穗狀花序，花有香味，可食用。劉德光等[2]人對刺槐進行研究認為其結實率低，授粉受精是雜交工作的基礎，花粉萌發和生長是授粉受精的關鍵問題。不同單株、無性系，不同種的紅花刺槐，常常花期不遇，有的還表現花粉活力低、不萌發、生長差、難以實現授粉受精，從而導致雜交失敗[4]。研究紅花刺槐花粉的貯藏方法與生活力對其雜交育種和品種改良都具有重要意義，該研究旨在找出快速準確測定刺槐花粉活力的方法，為紅花刺槐的后續雜交育種工作提供數據支撐。

1　材料與方法

1.1材料材料為北京市延慶縣石佛寺野生紅花刺槐，生長地地理坐標為115°50′E、40°23′N，海拔約為500 m；年平均氣溫8 ℃，1月最冷，平均氣溫-8.8 ℃，7月最熱，平均氣溫為23.2 ℃；日照充足，年平均日照時數2 826.3 h，年平均降雨量493 mm。紅花刺槐始花期一般為5月中旬，持續到6月初，約15 d。試驗所需蔗糖、硼酸、瓊脂、亞甲基藍等藥品均由北京化工廠提供；光學顯微鏡為德國麥克奧迪的Motic B series；培養箱為PYX-250G-A光照培養箱。

1.2方法2016年6月于北京市農林科學院林業果樹研究所進行試驗。采集即將開放的紅花刺槐花蕾，預處理后帶回實驗室剝取花藥，放于白紙上自然陰干24 h，碾壓花藥使其破裂散粉，過篩后將花粉放入密封小玻璃瓶中，保存待用。1.2.1培養基法測定萌發率。利用蔗糖硼酸培養基培養花粉[5]，設置蔗糖濃度為0(清水對照)、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mg/L共6個處理，硼酸濃度為0(清水對照)、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/L共5個處理，共設置30組試驗。待培養基冷卻后用毛筆將花粉點涂在培養基上，置于25 ℃恒溫培養箱保濕培養24 h，在光學顯微鏡下觀測萌發情況，以花粉管萌發的長度超過2倍的花粉直徑為萌發花粉。每載玻片取5個視野，統計100 粒，然后計算花粉萌發率，重復3 次[6]。

1.2.2染色法測定生活力。

1.2.2.1TTC法。取少量花粉置于凹載玻片上，滴2滴0.4 g/L TTC 溶液，置于35 ℃恒溫箱中15 min，于顯微鏡下觀察，有活力的花粉被染成紅色[5]。每載玻片取5個視野，統計100粒，然后統計花粉生活力，重復3次。

1.2.2.2 I2-KI染色法。取少量花粉置于凹載玻片上，滴2滴I2-KI溶液，置于30 ℃恒溫箱中20～30 min，在顯微鏡下觀察，有生活力的花粉被染成藍色，生活力衰弱或內含物少的花粉被染成黃褐色[7]。每載玻片取5個視野，統計100粒，然后統計花粉生活力，重復3 次。

1.2.3不同貯藏時間對花粉生活力的影響。試驗分為常溫保存(25 ℃)和低溫保存(0 ℃)，利用優選培養基進行培養，分別設置4個保存天數，從花粉采收后第1天算起，每5 d觀察1次，每次觀察2個重復，每個重復隨機觀察5個視野。根據所拍照片，以花粉粒直徑為標準，計算花粉管長度為花粉粒直徑的倍數(a)，當a>1時，即可進行花粉萌發計算，花粉萌發率=觀察視野內萌發總數/觀察視野內花粉粒總數×100%。根據花粉管的伸長情況可判斷花粉的萌發活力，花粉管伸長越快、越長，證明花粉活力越大。花粉保存方法的比較：根據2組不同貯藏條件與保存時間對照，分析花粉管的萌發長度、時間以及花粉活力，以確定花粉的最佳保存方法與時間。

2　結果與分析

2.1不同培養基濃度對紅花刺槐花粉萌發率的影響由表1可知，蔗糖和硼酸濃度為0時，抑制紅花刺槐花粉的萌發，在恒溫箱中培養24 h的花粉萌發率僅有0.32%。當培養基中加入蔗糖和硼酸后，花粉的萌發率明顯增高，隨著蔗糖和硼酸濃度的增高，花粉的萌發率呈現出先上升再下降的趨勢。蔗糖濃度達25.0 mg/L時，培養基中的平均花粉萌發率最高，約為21.15%，而蔗糖濃度為30.0 mg/L時，花粉萌發率明顯下降。硼酸濃度為1.5 mg/L時，培養基中的平均萌發率為16.51%，硼酸濃度為2.0 mg/L時，培養基中的平均萌發率為22.98%。所有培養基中，當蔗糖濃度為20.0 mg/L、硼酸濃度為2.0 mg/L時，紅花刺槐花粉的萌發率最高，達29.56%，說明只有在適量的蔗糖與硼酸組合中，才能達到相對較高的花粉萌發率。

表1　不同培養基濃度對紅花刺槐花粉萌發率的影響

2.2不同染色法對紅花刺槐花粉生活力測定的效果由表2及圖1可知，紅花刺槐的花粉經I2-KI染色后，呈現紅褐色和黃褐色，與花粉遇I2-KI變藍色的理論不符，且所有的花粉均有染色，并不能以此說明所有花粉都具有生活力，可見I2-KI染色法不適合紅花刺槐花粉生活力的測定。

經0.4 g/L的TTC溶液染色后，84.54%的紅花刺槐花粉被染成深紅色，10.00%左右的花粉被染成淺紅色，未被染色的僅有5.48%，而TTC染色效果與培養基的萌發效果差別較大，TTC染色法是否可以檢驗花粉生活力有待討論。

表2　不同染色法對紅花刺槐花粉生活力測定的結果

圖1　I2-KI及TTC染色結果Fig.1　I2-KI and TTC staining results

2.3不同貯藏時間對花粉生活力的影響利用培養基試驗中最優培養基進行不同保存時間紅花刺槐的花粉萌發率測試，發現常溫保存的花粉萌發更早，花粉管先開始伸長，而低溫保存的花粉總體萌發率要高于常溫保存的，但花粉管的伸長差距并不明顯，花粉管長度基本為花粉粒直徑的8～10倍。在常溫和低溫下保存5 d時，具有最佳萌發率，常溫保存萌發率為24.91%，低溫保存萌發率為31.82%。由圖2和表3可知，低溫保存的紅花刺槐花粉的萌發率要高于常溫保存的花粉，最大差距是在保存10 d時，低溫保存的花粉萌發率(20.23%)要明顯高于常溫保存的萌發率(10.58%)。在保存過程中，由于重疊等原因，一直存在不能吸收培養液的干燥花粉粒，或者吸收了培養液而最終并沒有萌發。

圖2　紅花刺槐在常溫與低溫條件下保存5 d時的萌發效果Fig.2　The germination effect of Robinia pseudoacacia stored in normal temperature and low temperature for 5 days

處理Treatment保存時間Storagetime∥d萌發粒數Germinationgrainnumber∥粒花粉總數Totalnumberofpollen∥粒花粉萌發率Pollengerminationrate∥%平均花粉萌發長度Averagepollengerminationlength常溫保存1113102511.029Storedinnormal5278111624.9110temperature(25℃)10137129510.5810158713396.656低溫保存1125113611.009Storedinlow5392123231.8211temperature(0℃)10224110720.231015258146017.678

注：花粉萌發長度為花粉粒直徑的倍數。

Note：The length of pollen germination is multiple of the diameter of pollen grain.

3　結論與討論

目前，檢驗花粉生活力的主要方法有染色法、離體萌發法及授粉法等[8-9]，人工授粉法是鑒定花粉保存效果比較可靠和精確的方法。花粉活力不僅受遺傳因素決定，也受環境因素的影響。賈文慶[10]研究認為，蔗糖不僅可調節花粉的滲透勢，還可以作為合成淀粉的原料，促進花粉管的伸長。該試驗發現隨著蔗糖濃度的增加，紅花刺槐花粉萌發率也逐步增大，蔗糖濃度超過25.0 mg/L時，紅花刺槐花粉的萌發率降低，與金愛紅等[11]發現蔗糖濃度過高會造成花粉的質壁分離，從而抑制花粉萌發的研究結果一致。該試驗表明花粉萌發同時受硼酸濃度的調控，只有在適量的蔗糖與硼酸組合中，才能得到相對較高的花粉萌發率，適合刺槐花粉萌發的蔗糖與硼酸組合為蔗糖20.0 mg/L+硼酸2.0 mg/L。

I2-KI染色法是檢測花粉生活力的常用方法，花粉粒中含有淀粉，遇I2變藍，而該試驗中花粉染色后呈現紅褐色和黃褐色，與所查資料不符，因此判定I2-KI染色法不適用于紅花刺槐花粉活力的測定。TTC染色法適用于大多數植物花粉生活力測定，在芍藥、油茶等花粉生活力測定中效果明顯[12-13]。花粉的著色情況可能受其自身特性影響[14]，一般花粉活性越高，其著色程度越深，該試驗用0.4 g/L TTC溶液對紅花刺槐花粉進行染色后，呈現深紅色、淺紅色、無色3種情況，染成深紅色的花粉粒達總數的85%左右，而培養基的最高萌發率僅有29.56%，可能是由于培養基中存在不能吸收培養液的干燥花粉粒，或者吸收了培養液而最終并沒有萌發，染色法測定的是花粉仍具有活力，而活性稍弱的花粉在培養基中可能不能萌發。檢測花粉生活力的染色方法還有CAB法、Kew法[15]等，何種染色法適合紅花刺槐花粉生活力測定有待進一步研究。

在花粉的超低溫保存中，超低溫對花粉細胞內含物質是否造成影響也是一個值得研究的問題。研究表明，在牡丹花粉超低溫保存前后，可溶性蛋白、脯氨酸、MDA、SOD、CAT、POD及可溶性糖含量均有一定程度的變化[16]。該試驗選擇常溫保存和低溫保存2種方法進行比較，紅花刺槐花粉開放當天采收，在常溫和低溫下保存5 d時，具有最佳萌發率，常溫保存萌發率為24.91%，低溫保存萌發率為31.82%，隨著保存時間的延長，花粉的萌發率逐步降低，常溫保存的萌發率較低溫保存下降更快，常溫條件下花粉會更快地失去活

力，不能萌發或不能充分伸長，因此低溫更適合紅花刺槐花粉的保存。有研究表明國槐花粉在低溫下保存的最長時間為39 d[17]，而紅花刺槐花粉在低溫條件下保存的最長時間仍有待研究。

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Viability Determination and Storage Property ofRobiniahisqidaPollen

LI Juan1, YAO Yan-wu2*

(1. Yanshan Bureau of Agriculture and Forestry of Cangzhou in Hebei Province, Cangzhou, Hebei 061300; 2. Forestry and Pomology Institute, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100093)

[Objective] The assay method of pollen viability and its storage characteristics were explored to provide

for the production and breeding ofRobiniahisqida. [Method] The pollen viability ofRobiniahisqidawas detected by medium germination, I2-KI staining and TTC staining test. Meanwhile the effects of different storage conditions and time on theRobiniahisqidapollen germination were studied. [Result] The germination rate ofRobiniahisqidapollen was 29.56% under 20.0 mg/L sucrose + 2.0 mg/L boric acid. The temperature of 0 ℃ was more suitable and storable than normal temperature, the method of I2-KI did not apply to the determination ofRobiniahisqidapollen vitality test, determination of the TTC method effect remained to be further tested. At 0 ℃, the germination rate of pollen was 17.67% when it was preserved for 15 days. [Conclusion] The most suitable medium of theRobiniahisqidapollen germination was 20.0 mg/L sucrose +2.0 mg/L boric acid. AndRobiniahisqidapollen stored in the low temperature conditions remained longer vigor.

Robiniahisqida; Pollen viability; Storage conditions

北京市農林科學院基金項目(KJCX20150205)。

李娟(1985-)，女，河北滄州人，助理工程師，從事林果技術工作。*通訊作者，副研究員，從事林木育種研究。

2016-07-13

S 792.27

A

0517-6611(2016)23-141-03