Wnt/β—Catenin在骨髓基質干細胞

姚宏波+廉潔+郎尉雅+孫麗慧+張海燕+李林

[摘要]目的探討BMSCs移植對AD模型大鼠的治療作用。方法將大鼠隨機分成5組，正常組、模型組、模型對照組、治療組、治療對照組，每組10只。雙側海馬區注射Aβ建立AD大鼠模型后，治療組進行BMSCs的移植治療。治療對照組用氫溴酸加蘭他敏進行灌胃治療。結果行為學實驗檢測各組大鼠平均逃避潛伏期及首次跨越原平臺時間，模型組與正常組比較（P<0.01），治療組與治療對照組與模型組比較（P<0.01），與正常組比較（P<0.05），均有顯著性差異；形態學實驗HE染色顯示模型組顆粒細胞及錐體細胞有破壞現象，治療組和治療對照組明顯恢復。免疫組化檢測顯示正常組和模型對照組可見海馬區陽性蛋白表達較多而模型組陽性表達明顯減少，治療組和治療對照組陽性表達較模型組明顯增多。結論BMSCs移植治療AD的作用機制可能與通過調節Wnt信號轉導通路，影響了學習記憶相關酶及蛋白在海馬區的表達而發揮作用有關。

[關鍵詞]Wnt/β-Catenin；骨髓基質干細胞；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病（alzheimers disease，AD）是一種中樞神經系統退行性疾病，其神經組織無法自然恢復。因此，體外誘導多能干細胞分化進行細胞移植來修復受損的神經組織已經成為研究的熱點之一。近年來發現，Wnt信號通路控制著體內多種程序，例如細胞的增殖、自我更新、細胞分化、細胞極性、細胞死亡等過程。Wnt信號通路與AD的病理過程存在著十分密切的關系，同時在神經干細胞的增殖、分化以及遷移等方面也起著重要的作用。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchvmalstem cells，BMSCs）在中樞神經組織移植中有明顯優勢，是一種良好的細胞替代治療的靶細胞。因此本研究希望通過觀察Wnt通路相關蛋白β-Catenin的變化，探討BMSCs移植對AD模型大鼠的治療作用。

1材料與方法

1.1材料

清潔級健康Wistar雄性大鼠50只，體重180～220g，由吉林大學醫學院提供；Moriss水迷宮；大鼠腦立體定位儀；Aβ美國Biosource公司；氫溴酸加蘭他敏，陜西森弗生物技術有限公司；β-Catenin測試盒購自武漢眾一生物試劑經營部。

1.2實驗動物分組

健康Wistar大鼠雄性50只隨機分成5組，正常組、模型組、模型對照組、治療組、治療對照組，每組10只。

1.3方法

正常組：常規飼養，不進行任何處理。模型組：稱重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腦立體定位儀固定，暴露頂骨，根據大鼠腦立體定位儀圖譜，選擇大鼠海馬區進行注射雙側海馬區注射Aβ每側10μL，5min內注完，注射后留針5min，術后用牙托粉封固骨孔，縫合皮膚，三日內每日肌注青霉素G10萬單位。造模后7天，利用Moriss水迷宮進行試驗，檢測造模是否成功，成功后不進行任何治療。模型對照組，注射生理鹽水代替Aβ方法同模型組。治療組：建立AD大鼠模型后，進行BMSCs的移植治療，將培養好的BMSCs向AD模型大鼠雙側海馬內注射，注射部位為原Aβ的注射部位，術后處理同模型組。治療對照組：建立AD大鼠模型后，用氫溴酸加蘭他敏，以每日每千克體重0.6mg灌胃，治療30d。

1.4測定方法

1.4.1行為學實驗在造模后7d及治療30d后，進行Morris水迷宮實驗：定位航行實驗用于測量大鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力。將大鼠進行水迷宮學習訓練3d。記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間，即逃避潛伏期。空間探索實驗用于測量大鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力。定位航行實驗結束后，即第4d開始撤去平臺，將大鼠從同一個入水點放入水中，測驗大鼠對原平臺的記憶。記錄其第一次到達原平臺位置的時間。

1.4.2形態學實驗各組大鼠行為學檢測完畢，取腦組織海馬進行石蠟切片制作并采用HE染色觀察海馬神經元的形態結構的改變。

1.4.3免疫組化染色

采用PV二步法進行免疫組化檢測各組AD大鼠海馬組織細胞中Wnt信號通路相關蛋白β-Catenin的表達，其中陰性對照組應用0.01MPB緩沖液代替一抗，顯微鏡觀察。

1.5統計學處理

采用Image-Proplus5.0圖像分析軟件及SPSS17.0軟件進行數據分析，進行t檢驗，計量資料以（x±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1行為學檢測

定位航行實驗和空間探索實驗檢測各組大鼠平均逃避潛伏期及首次跨越原平臺時間。模型組大鼠逃避潛伏期及首次跨越平臺時間均比正常組降低，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，治療對照組及治療組大鼠學習記憶能力有明顯改善，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2形態學檢測

各組大鼠行為學檢測完畢，取腦組織海馬進行石蠟切片制作并采用HE染色觀察海馬神經元的形態學改變。見圖1。

A和B兩圖可見海馬區顆粒細胞及錐體細胞呈多層規則排列，整齊而緊密。神經元內胞漿豐富，顆粒細胞核大而圓，染色質較淺，核膜清楚，可見清晰嗜堿性核仁；錐體細胞樹突豐富，長而整齊地向海馬伸展；c圖顆粒細胞及錐體細胞有破壞現象，細胞排列稀疏、紊亂，細胞體積縮小，間隙擴大，出現胞漿濃縮深染和胞核固縮，錐體細胞樹突變短，稀疏；D和E圖海馬區顆粒細胞排列較規整，細胞清晰，核圓，核仁明顯，細胞數量減少。

2.3wnt信號通路相關蛋白β-Catenin的表達

A和B兩圖可見海馬區陽性蛋白表達較多，可見較多棕黃色顆粒主要位于胞漿內；C圖陽性表達明顯減少；D和E圖海馬區陽性表達與C圖比較明顯增多，接近于A圖和B圖。見圖2。

3討論

AD是中樞神經系統退行性疾病，主要表現為學習記憶能力損害，是老年癡呆最常見的一種。腦內老年斑形成、含有tau蛋白的神經纖維纏結以及神經元缺失變性是其三大病理學特征。Wnt信號通路的激活能夠阻止β-淀粉樣蛋白引起的神經毒性對神經元的損害。此外，突觸丟失誘導的神經元死亡也是AD發病的危險因素之一。如果突觸組裝與去組裝行為發生失衡，那么便可能會引起神經退行性病變，激活Wnt信號通路能夠通過促進突觸發生而保護神經元。大量研究表明，Wnt信號通路參與了有功能的完整的神經元產生的大部分過程，故Wnt信號通路在AD的發生中起著重要的作用。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌作用與位于細胞膜上的受體相結合，激活細胞內信號通路，調節靶基因的表達，在胚胎的發育過程中對細胞的增殖、分化、遷移、極性化和凋亡均起到重要的作用。神經元死亡是神經退行性疾病如AD、帕金森病以及腦中風、腦外傷等最為重要的病理特征。研究發現，精神分裂癥患者腦內Wnt信號通路失調，通路中的胞內β-Catenin含量明顯減少。β-Catenin基因位于3p21，編碼蛋白分子量約92kD，是Wnt信號通路中的重要一員，是正向調節因素。Wnt信號的傳遞取決于胞漿內游離β-catenin的水平。Wnt/β-Catenin信號途徑對神經系統的發育、神經干細胞的增殖和分化都有著重要的作用，細胞內游離β-Catenin的水平能夠影響-神經元樹突的形態發生，同時，高水平的β-Catenin還可促進神經元樹突的分枝。

BMSCs是存在于骨髓腔內的多能干細胞，具有獨特的免疫學特征，是理想的組織工程種子細胞。因其來源廣泛，取材方便，增殖能力強，并且具有多向分化能力，在特定的條件下能被誘導分化為骨、軟骨、脂肪等中胚層細胞，所以被廣泛應用于再生醫學行列，在一些神經系統疾病如神經退行性疾病的治療中發揮作用。Lee等發現，將BMSCs移植到AD大鼠海馬的齒狀回附近，細胞移植組的β-淀粉樣蛋白水平下降，并且β-淀粉樣蛋白沉積的減少伴隨著小膠質細胞的激活，小膠質細胞常常出現在β-淀粉樣蛋白沉積的附近，因此BMSCs具有清除β-淀粉樣蛋白沉積和/或阻斷β-淀粉樣蛋白沉積形成的作用。

本研究發現，BMSCs移植治療后，在AD模型大鼠的行為學、形態學以及免疫組化等檢測方面，均有明顯改變，符合上述研究發現。因此，深入闡明Wnt信號在干細胞中的精確功能，在干細胞增殖分化中的具體機制及其與AD的關系，對將來臨床BMSCs治療AD等神經系統退行性疾病方面具有非常重要的意義。