茶樹3類滲透調節物質與冬春低溫相關性及其品種間的差異評價

薄曉培，王夢馨，崔 林，王金和，韓寶瑜

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茶樹3類滲透調節物質與冬春低溫相關性及其品種間的差異評價

薄曉培1，王夢馨1，崔 林1，王金和2，韓寶瑜1

（1中國計量大學浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州310018；2江蘇吟春碧芽股份有限公司，江蘇丹陽212345）

【目的】探討2個茶樹品種可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸等3類滲透調節物質含量變化及其與冬春期間氣溫的相關性，評價其對低溫的響應程度及其品種間的差別?！痉椒ā窟x早芽品種‘平陽特早’和‘中茶102’，連續2年于10月21日至翌年4月5日逐日記載茶梢間氣溫，每天8：00、14：00、20：00記錄干濕球溫度計的溫度，每日3次測得的每塊茶園3支干球溫度計的平均值即為當日茶梢生境氣溫；測溫期間每月5日、15日、25日采摘成葉，以蒽酮比色法測定茶鮮葉可溶性糖含量，將剩余擦拭干凈的鮮葉蒸青、烘干制成蒸青茶樣，用SDE-HPLC方法測定茶干葉脯氨酸和游離氨基酸含量?！窘Y果】根據茶樹的發育起點溫度和休眠溫度，將試驗階段分為越冬期（2013/10/21—2014/3/5，2014/10/21—2015/3/5）和早春期（2014/3/6—2014/4/5，2015/3/6—2015/4/5）2個階段。①連續2年試驗的越冬期間（2013/10/21—2014/3/5，2014/10/21—2015/3/5），氣溫先逐漸下降，再持續低溫；2個品種成葉的可溶性糖含量相應地升高、再升高，與旬平均氣溫顯著負相關；脯氨酸含量升高、保持，與旬平均氣溫顯著負相關；游離氨基酸含量則為下降、保持，與旬平均氣溫顯著正相關；當溫度出現最低值時，可溶性糖含量和脯氨酸含量相應出現最高值，游離氨基酸含量也跟隨著出現最低值，而當溫度出現最高值時，可溶性糖含量和脯氨酸含量隨后也就相應地出現最低值，游離氨基酸含量隨之也相應地出現最高值。②2年試驗的早春期間（2014/3/6—2014/4/5，2015/3/6—2015/4/5）氣溫漸升，可溶性糖含量趨于減少，脯氨酸、游離氨基酸含量趨于增加；③茶樹抗凍性與溫度密切相關，茶鮮葉可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸含量與茶樹的抗凍性密切相關，2年越冬期間，與‘中茶102’相比，在遭受冬季低溫脅迫時，‘平陽特早’3類滲透調節物質對低溫的響應性、響應幅度分別更靈敏、更大，‘平陽特早’3類滲透調節物質含量稍多?！窘Y論】深秋至清明期間茶樹易受凍害和倒春寒，其中越冬期間可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸皆能敏感地響應低溫變化，三者含量分別與旬平均氣溫顯著相關，是茶樹的重要抗凍指標；‘平陽特早’品種對于低溫響應程度大于‘中茶102’。

低溫；茶樹；凍害；可溶性糖；脯氨酸；游離氨基酸

0 引言

【研究意義】近年來，中國江北和江南茶區茶園面積持續擴展，而深秋至早春的極度嚴寒和“倒春寒”不期而至，常常導致大片茶園受凍[1-2]。早春日平均氣溫高于10℃時，茶芽開始萌動，代謝活動增強，假以時日即可采制高檔茶葉。然而萌動了的茶芽抗寒性減弱，若氣溫驟降，則會受凍而死，延遲大批茶芽的萌發并降低萌發率，進而導致春茶減產和品質降低[3-4]?！厩叭搜芯窟M展】茶樹具備抗凍生理生化機制，茶鮮葉脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量隨氣溫的降低皆呈先升后降的變化趨勢，但不同茶樹品種響應低溫脅迫的溫度范圍有所不同[5]。有研究者認為可溶性糖含量高低可作為判斷茶樹品種或新梢抗寒性強弱的一個指標[6]。也有研究者指出冷馴化中茶樹體內脯氨酸含量變化是對外界條件變化的一種綜合反應，很難說明單一的脯氨酸含量與抗寒力之間的因果關系[7]。還有研究者認為可溶性糖和脯氨酸都是植物體內重要的抗寒物質[8-10]?！颈狙芯壳腥朦c】關于脯氨酸含量與茶樹抗寒性的關系，目前的研究還存在異議；而且關于游離氨基酸含量與茶樹抗寒性的研究較少；茶樹抗寒特早生品種的選育一直成為炙手可熱的話題。為探討茶樹抗凍的物質基礎，田野等[11]從2013年深秋至2014年早春研究了‘烏牛早’和‘茂綠’品種抗凍性，檢測了成葉中可溶性糖、脯氨酸、游離氨基酸含量與冬春氣溫相關性，發現這3類物質與低溫密切相關，可作為茶樹“抗凍指標”，且可溶性糖含量與溫度相關性更密切，‘烏牛早’抗性強于‘茂綠’?！緮M解決的關鍵問題】本研究于2013年10月21日至2014年4月5日、2014年10月21日至2015年4月5日連年檢測早芽種[12-13]‘平陽特早’和‘中茶102’可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸含量，分析這3類物質分別對于低溫響應程度和含量變化，以及其在這2個早芽種成葉中的含量差異，比較2個品種對于低溫的敏感性。

1 材料與方法

1.1 試驗茶園與茶梢生境氣溫調查方法

2013年10月21日至2014年4月5日、2014年10月21日至2015年4月5日在中國計量大學試驗茶園（北緯30°19′29.90″，東經120°21′19.16″，海拔11 m）選‘平陽特早’和‘中茶102’2個茶樹品種，樹齡6年，樹高95 cm、樹幅寬100 cm。每個品種園約為80 m2正方形，在每塊試驗茶園單對角線的茶叢內各放3支干濕球溫度計，貼近茶梢，溫度計頂端與茶芽平齊。每天8：00、14：00、20：00記錄干濕球溫度計的溫度和濕度，每日3次測得的每塊茶園3支干球溫度計的平均值即為當日茶梢生境氣溫。

1.2 茶鮮葉3類滲透調節物質的檢測

1.2.1 樣品可溶性糖檢測 試驗期間的每月5日、15日、25日采集茶芽下第2至6片葉，用干凈濕潤的紗布輕輕擦去葉面灰塵。稱取0.500 g鮮葉，剪碎放入具塞試管中，加10 mL蒸餾水，浸入沸水中提取1 h，冷卻后3 000 r/min離心10 min，上清液即為待測液。采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量。每個樣品重復6次，平均值即為當日檢測值。

1.2.2 樣品氨基酸檢測 將剩余擦拭干凈的鮮葉蒸青、烘干制成蒸青茶樣。將蒸青樣研磨均勻，稱取2.000 g茶粉放入100 mL具塞錐形瓶中，加入75 mL蒸餾水，搖勻，于沸水中提取1 h。冷卻后，2 000 r/min離心5 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，吸600 μL濾液至2 mL離心管，加入0.2 mol·L-1PITC-乙腈溶液、1 mol·L-1三乙胺-乙腈溶液各200 μL，混勻，室溫放置1 h。加正己烷400 μL，渦旋振蕩30 s，靜置10 min，取下層溶液至棕色小瓶，即為待測液。每個樣品重復3次。采用高效液相色譜法測定脯氨酸和17種游離氨基酸含量。色譜條件參照田野等[11]的方法并改進。

氨基酸定量分析：用50%的乙腈將氨基酸標準品原液進行不同濃度梯度的稀釋，分別稀釋10倍、20倍、50倍、100倍，用高效液相色譜法測定峰面積，將不同濃度梯度的標準品按其峰面積和濃度制做成標準曲線，根據測得樣品的峰面積，通過標準曲線計算出樣品中氨基酸的含量。

1.3 數據處理

茶樹發育起點溫度是10℃，嚴冬來臨時日平均溫度低于10℃則開始休眠，早春時節高于10℃茶樹便開始發芽[14]，因此，將試驗階段分為越冬期（2013/10/21—2014/3/5，2014/10/21—2015/3/5）和早春期（2014/3/6—2014/4/5，2015/3/6—2015/4/5）2個階段。

以ORIGIN軟件作出滲透調節物質含量（g·g-1）-氣溫關系圖，觀察各類滲透調節物質含量隨著氣溫的變化趨勢，比較2個供試品種之間滲透調節物質含量的差異。為便于數值分析，文中各類物質含量皆用百分含量；以旬平均氣溫為自變量，以各類滲透調節物質含量分別為因變量，用DPS軟件求出相關系數并檢驗顯著性，建立回歸方程。

2 結果

2.1 越冬期和早春期2個品種茶鮮葉可溶性糖含量動態及其與氣溫關系

依據茶樹發育起點為10℃的標準，將越冬期分為第1階段（2013/10/21—2013/12/5和2014/10/21—2014/12/5）和第2階段（2013/12/6—2014/3/5和2014/12/6—2015/3/5），其中第1階段為深秋至初冬時期，氣溫持續下降，日均溫≥10℃；第2階段為寒冷的嚴冬期間，日均溫≤10℃。2013—2014年嚴冬期間，氣溫變幅劇烈，還有3 d日平均氣溫低于0℃，即-0.38℃（2013/12/27）、-0.93℃（2013/12/28）和-0.09℃（2014/2/10），平均氣溫6.42℃；2014—2015年嚴冬期間氣溫變化相對平緩且日均溫均在0℃ 以上，最低溫度為1.97℃（2015/1/1），平均溫度6.98℃。早春期（2014/3/6—2014/4/5和2015/3/6—2015/4/5）溫度呈上升趨勢，日均溫≥10℃，茶芽逐漸萌發（圖1）。

2013—2014年越冬期間，‘中茶102’可溶性糖平均百分含量（4.19%）低于‘平陽特早’（4.68%）。第1階段（2013/10/21—2013/12/5），‘中茶102’和‘平陽特早’可溶性糖含量逐漸上升，該階段‘中茶102’從0.0374 g·g-1（2013/10/25）增加為0.0467 g·g-1（2013/12/5），上升了24.87%，‘平陽特早’從0.0283 g·g-1（2013/10/25）增加為0.0478 g·g-1（2013/12/5），上升了68.90%。第2階段（2013/12/6—2014/3/5），‘中茶102’平均含量為0.0446 g·g-1，比第1階段平均含量0.0370 g·g-1上升了20.54%，‘平陽特早’ 平均含量為0.0519 g·g-1，比第1階段平均含量0.0374 g·g-1上升了38.77%。當最低氣溫在2013/12/27、2013/12/28和2014/2/10出現，分別為-0.38℃、 -0.93℃和-0.09℃時，相應地‘中茶102’可溶性糖百分含量在2014/1/5出現1個峰值（4.93%）、在2014/2/15再出現1個峰值（4.95%）；而‘平陽特早’在2014/2/15也出現1個峰值（7.95%）。在2014年1月底氣溫突然升高時，‘中茶102’可溶性糖百分含量在2014/2/5出現低谷（3.42%），‘平陽特早’在2014/2/5也出現低谷（3.23%）。

早春期間（2014/3/6—2014/4/5），‘中茶102’可溶性糖平均含量（4.53%）高于‘平陽特早’（4.19%）（圖1）。

圖1 越冬期和早春期2個品種茶鮮葉可溶性糖含量波動及其與溫度關系

2014—2015年越冬期間，‘中茶102’可溶性糖平均百分含量（5.30%）高于‘平陽特早’可溶性糖平均百分含量（4.91%）。第1階段（2014/10/21—2014/12/5），‘中茶102’可溶性糖含量從0.0215 g·g-1（2014/10/25）升至0.0470 g·g-1（2014/12/5），升高了1.2倍；‘平陽特早’的可溶性糖含量從0.0211 g·g-1（2014/10/25）上升至0.0528 g·g-1（2014/12/5），升高了1.5倍；第2階段（2014/12/6—2015/3/5），‘中茶102’平均含量為0.0637 g·g-1，比第1階段平均含量0.0337 g·g-1上升了89.13%；‘平陽特早’平均含量為0.0597 g·g-1，比第1階段平均含量0.0300 g·g-1上升了99.13%。在2015年2月15日溫度驟然升高，2種茶樹的可溶性糖含量在2月25日分別下降了21.47%（‘中茶102’）和29.13%（‘平陽特早’）。

在早春階段（2015/3/6—2015/4/5），‘中茶102’可溶性糖的平均百分含量（4.26%）高于‘平陽特早’（2.73%）。

2.2 越冬期和早春期2個品種茶鮮葉脯氨酸含量動態及其與氣溫關系

2013—2014年越冬期間（圖2），‘中茶102’的脯氨酸平均百分含量0.13%高于‘平陽特早’平均百分含量0.07%。在越冬期第1階段（2013/10/21—2013/12/5），‘中茶102’的脯氨酸含量由0.0034 g·g-1（2013/10/25）逐漸降至0.0015 g·g-1（2013/12/5），降低了55.88%，‘平陽特早’脯氨酸含量由0.0009 g·g-1（2013/10/25）下降至0.0006 g·g-1（2103/12/5），降低了33.33%。

圖2 越冬期和早春期2個品種茶葉脯氨酸含量波動及其與溫度關系

越冬期第2階段（2013/12/6—2014/3/5），‘中茶102’脯氨酸平均含量為0.0009 g·g-1，比第1階段平均含量0.0019 g·g-1下降了52.63%；‘平陽特早’脯氨酸平均含量為0.0007 g·g-1，比第1階段平均含量0.0006 g·g-1升高了16.67%。當最低氣溫在2013/12/27、2013/12/28和2014/2/10出現，分別為-0.38℃、-0.93℃和-0.09℃時，‘中茶102’脯氨酸含量在2014/1/5出現1個峰值0.0019 g·g-1；‘平陽特早’脯氨酸含量在2014/2/15出現1個峰值0.0010 g·g-1。在2014年1月底溫度突然升高時，2個品種茶樹的脯氨酸含量在2014/1/25同時出現低谷，皆為0.0002 g·g-1。

早春期間（2014/3/6—2014/4/5），‘中茶102’的脯氨酸平均百分含量為0.11%，是‘平陽特早’百分含量0.05%的2倍。

2014—2015年越冬期間‘中茶102’的脯氨酸平均百分含量為0.03%，高于‘平陽特早’平均百分含量0.01%。在越冬期第1階段（2014/10/21—2014/12/5），中茶102脯氨酸百分含量由0.06%（2014/10/25）逐漸降低至0.03%（2014/12/5），下降了50.00%；平陽特早脯氨酸百分含量由0.0060%（2014/10/25）升至0.0162%（2014/12/5），升高了1.70倍。在越冬期第2階段（2014/12/6—2015/3/5），‘中茶102’脯氨酸平均百分含量0.0262%，比第1階段脯氨酸平均百分含量0.0383%下降了31.59%；‘平陽特早’脯氨酸平均百分含量0.0162%，比第1階段平均百分含量0.0077%升高了1.10倍。2015年2月15日溫度驟然升高，2種茶樹的脯氨酸含量在2014/2/25分別下降了41.07%（‘中茶102’）和31.26%（‘平陽特早’）。早春階段（2014/3/6—2014/4/5），脯氨酸含量有所下降，‘中茶102’的脯氨酸平均百分含量為0.0162%，比‘平陽特早’（0.0047%）高了3倍。

2.3 越冬期和早春期2個品種茶鮮葉游離氨基酸含量動態及其與氣溫關系

2013—2014年越冬期間，‘中茶102’游離氨基酸平均百分含量為0.0017 g·g-1，低于‘平陽特早’的游離氨基酸平均百分含量0.0027 g·g-1。在越冬期第1階段（2013/10/21-2013/12/5），‘中茶102’游離氨基酸含量由0.0029 g·g-1（2013/10/25）降至0.0019 g·g-1（2013/12/5），下降了34.48%，‘平陽特早’由0.0048 g·g-1（2013/10/25）降至0.0027 g·g-1（2013/12/5），下降了43.75%。在越冬期第2階段（2013/12/6—2014/3/5），‘中茶102’游離氨基酸的平均含量為0.0014 g·g-1，比第1階段平均含量0.0022 g·g-1降低了36.36%；‘平陽特早’游離氨基酸的平均含量為0.0022 g·g-1，比第1階段平均含量0.0034 g·g-1下降了35.29%。早春時期（2014/3/6—2014/4/5），2個茶樹品種游離氨基酸含量逐漸上升，‘中茶102’的平均含量（0.0019 g·g-1）低于‘平陽特早’平均含量（0.0035 g·g-1）。

2014—2015年越冬期間，‘中茶102’的游離氨基酸平均含量為0.0029 g·g-1，低于‘平陽特早’平均含量0.0035 g·g-1。越冬期第1階段（2014/10/21—2014/12/5），‘中茶102’的游離氨基酸含量由0.0043 g·g-1（2014/10/25）降至0.0036 g·g-1（2014/12/5），下降了16.28%；‘平陽特早’游離氨基酸平均含量由0.0046 g·g-1（2014/10/25）降至0.0036 g·g-1（2014/12/5），下降了21.74%。在越冬期第2階段（2014/12/6—2015/3/5），2個茶樹品種的游離氨基酸含量較低，‘中茶102’的游離氨基酸平均含量為0.0026 g·g-1，比第1階段的平均含量0.0034 g·g-1下降了23.53%；‘平陽特早’游離氨基酸的平均含量為0.0029 g·g-1，比第1階段平均含量0.0044 g·g-1下降了34.09%。在早春階段（2015/3/6—2015/4/5），游離氨基酸含量開始上升，‘中茶102’游離氨基酸的平均含量（0.0034 g·g-1）低于‘平陽特早’平均含量（0.0041 g·g-1）。

2.4 越冬期和早春期2個品種茶鮮葉3種滲透調節物質含量與氣溫的數值相關性

以旬平均氣溫為自變量，以滲透調節物質含量為因變量，檢驗抗凍物質含量與旬平均氣溫的相關性，并建立線性回歸方程（表1）。在2年試驗越冬期間第1階段和第2階段：‘中茶102’和‘平陽特早’的可溶性糖含量分別與旬平均氣溫顯著負相關；‘中茶102’和‘平陽特早’的脯氨酸含量與旬平均氣溫顯著負相關；‘中茶102’和‘平陽特早’的游離氨基酸含量與旬平均氣溫顯著正相關（表1）。

表1 越冬期間2個品種茶鮮葉3種滲透調節物質與氣溫的相關性

*表示在＜0.05水平上差異顯著，**表示在＜0.01水平上差異顯著 * significantly different at＜0.05, ** extremely significant different at＜0.01

2014/3/6—2014/4/5和2015/3/6—2015/4/5分別為2年試驗的早春期間，氣溫逐漸回升，可溶性糖含量趨向于減少（圖1），脯氨酸、游離氨基酸含量則分別趨向于增加（圖2和圖3）。

圖3 越冬期和早春期2個品種茶葉游離氨基酸含量波動及其與溫度關系

3 討論

3.1 滲透調節——可溶性糖

糖在植物生長中具有重要的調節作用，當植物受到環境脅迫時，可溶性糖含量增加并通過滲透調節增強植物的抵抗力[15-17]。植物受低溫脅迫一段時間之后，膜系統發生一系列生理生化變化，通透性增大，膜內可溶性物質外滲，細胞失水，植物組織便會受到損傷以致于死亡[18]。可溶性糖可調節細胞滲透壓，增大保水能力，能夠供給碳源和底物，誘導其他抗寒生理生化反應以提高植物的抗寒性；還可以保護蛋白質，避免蛋白質遭受低溫而發生凝固，以增強植物抗寒性[19-20]。本研究發現：在越冬期第1階段，可溶性糖含量伴隨著溫度的下降而上升；在越冬期第2階段，可溶性糖含量繼續升高，最低溫出現之后，可溶性糖含量峰值隨后也就出現；當溫度突然升高時，可溶性糖含量快速下降。說明可溶性糖靈敏地響應溫度變化；回歸分析表明越冬期可溶性糖含量與氣溫顯著負相關。這些與前人研究結果一致[21-23]，也與田野對于‘烏牛早’和‘茂綠’品種的研究結果一致[11]。在早春時期，溫度持續上升，‘中茶102’和‘平陽特早’的可溶性糖含量相比越冬期間略有下降，且與此時期的溫度無顯著相關性，‘中茶102’可溶性糖平均含量高于‘平陽特早’。

3.2 滲透調節——脯氨酸

在越冬期和植物萌芽期，脯氨酸的累積與植物生長密切相關[24-25]。脯氨酸作為植物體內一種滲透調節物質，當植物受到低溫脅迫時，游離脯氨酸能夠促進蛋白質的水合作用，保護酶結構的穩定，從而保護細胞免受傷害[19]。植物葉片的脯氨酸含量與植物抗寒力有顯著相關性，抗寒力強的植物在受到一定范圍的低溫脅迫之后，游離脯氨酸顯著增多[8, 10, 26-27]。但也有報道認為植物體內脯氨酸含量與植物抗寒力無顯著相關性[28]。也有研究表明脯氨酸的累積與植物對環境脅迫的響應無顯著相關性[29-30]。本研究表明，越冬期間，2個供試茶樹品種鮮葉游離脯氨酸含量變化雖沒有可溶性糖明顯，但2013—2014年、2014—2015年越冬期間2個品種茶樹脯氨酸含量皆分別與旬平均氣溫顯著負相關；并且在越冬期第2階段出現最低溫度時，2個品種茶樹脯氨酸含量隨著都有明顯升高，在2014年1月底氣溫突然升高時2個品種茶樹脯氨酸含量也隨著出現低谷，比較靈敏地響應溫度的變化。認為脯氨酸也是一種重要的滲透調節物質，促進茶樹抗凍，與前人研究結果一致[8, 10, 26-27]。在早春期間，‘中茶102’的脯氨酸含量高于‘平陽特早’，兩者的脯氨酸含量與氣溫無顯著相關性。

3.3 滲透調節——游離氨基酸

植物抗寒性與可溶性蛋白含量正相關[31]，植物遭受低溫脅迫后，體內可溶性蛋白遭到破壞而降解，造成氨基酸的累積。在低溫處理過程中，稻葉內游離氨基酸大量積累，與可溶性蛋白含量的下降極顯著相關[32]。另有研究表明植物在冷訓化過程中游離氨基酸含量增加[33]。游離氨基酸含量增加，加大植物C、N源的供給，增強蛋白對于水分子束縛，調節滲透性，也就增強了抗凍性，其抗凍機理尚待深入研究。

但本研究結果表明，越冬期茶樹鮮葉的游離氨基酸含量變化趨勢與氣溫一致；隨著溫度最低值的出現，游離氨基酸含量也相應的達到低谷，溫度升高時，游離氨基酸含量也逐漸升高，說明游離氨基酸含量比較敏感地響應溫度變化；茶鮮葉游離氨基酸含量與氣溫極顯著正相關。田野等[11]也發現2013年10月20日到翌年4月5日‘烏牛早’和‘茂綠’品種茶鮮葉游離氨基酸含量與氣溫正相關，但未達到顯著水平，可能是品種之間有差異，試驗時間也較短。也有研究證實霜凍脅迫會顯著影響茶葉游離氨基酸含量，在遭受霜凍脅迫時，游離氨基酸含量下降[34]。早春期氣溫升高時，游離氨基酸含量也相應地升高，明顯高于越冬期含量，‘中茶102’游離氨基酸含量低于‘平陽特早’。

3.4 三類滲透調節物質抗凍性能的初步評判以及‘平陽特早’和‘中茶102’抗凍性比較

優良的滲透調節物質，不僅具有增強茶樹免于凍害的生物效應，而且從深秋至嚴冬乃至早春倒春寒侵襲時能夠靈敏地響應低溫變化，具有生物統計學意義的相關性。有研究認為，茶樹抗凍性與溫度密切相關，茶鮮葉可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量與茶樹的抗凍性密切相關[35]。本研究發現，可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸在茶樹體內具有一定含量，2013—2014、2014—2015年越冬期間這3類物質與氣溫顯著相關，對于溫度的響應程度較大。在越冬期第1階段和第2階段，‘平陽特早’可溶性糖含量的升高幅度皆大于‘中茶102’的；在越冬期第2階段‘平陽特早’的脯氨酸含量相比第1階段顯著升高，而‘中茶102’的脯氨酸含量相比第1階段略有降低；‘平陽特早’游離氨基酸含量在越冬期第1階段下降幅度高于‘中茶102’，而在第2階段的平均含量高于中茶102。與‘中茶102’相比，在遭受冬季低溫脅迫時，‘平陽特早’3類滲透調節物質對低溫的響應性、響應程度分別更靈敏、更大，‘平陽特早’3類滲透調節物質含量稍多。

即便如此，茶樹品種抗凍性評價是一個復雜問題，還要結合電導率、酶活等可信的生理生化指標[6, 8, 10]、遺傳特性和田間凍害指數[36]等進行綜合評價，可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸含量只是其中的幾個參考指標。

4 結論

越冬期間可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸皆能敏感地響應空氣溫度的變化，三者含量分別與旬平均氣溫顯著負相關、顯著負相關和顯著正相關，被認為是茶樹的重要滲透調節物質，可作為抗凍指標。

越冬期間，‘平陽特早’可溶性糖含量、游離氨基酸含量明顯大于‘中茶102’，‘平陽特早’可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸對于低溫的變幅大于‘中茶102’的，因此，‘平陽特早’對低溫響應程度大于‘中茶102’。

References

[1] Hwang J G, Kim Y D. A survey low temperature damage of tea tree at South Korea in 2011., 2012, 14(4): 246-253.

[2] 楊俊虎, 張行才, 王超, 陸小強. 氣象因子與春茶及中高檔春茶產量的灰色關聯分析. 山西農業科學, 2012, 40(1): 53-55.

Yang J H, Zhang H C, Wang C, Lu X Q. Grey connection analysis of spring tea and high-middle grade spring tea yield with meteorological factors., 2012, 40(1): 53-55. (in Chinese)

[3] 朱秀紅, 袁洪剛, 鄭海濤. 近45年山東茶樹凍害氣候原因分析. 中國茶葉, 2012(3): 11-13.

Zhu X H, Yuan H G, Zheng H T. Analysis on frozen injury weather of Shandong tea plants., 2012(3): 11-13. (in Chinese)

[4] 吳華玲, 陳棟, 李家賢. 廣東茶區“倒春寒”凍害情況的調查與反思. 廣東農業科學, 2010(7): 39-41.

Wu H L, Chen D, Li J X. Investigation and reflection of late spring coldness frozen injury from Guangdong tea-producing area., 2010(7): 39-41. (in Chinese)

[5] 黃海濤, 余繼忠, 王賢波, 張偉, 周鐵鋒, 敖存. 不同抗寒性茶樹品種秋季新梢的生理特性研究. 浙江農業學報, 2014, 26(4): 925-928.

Huang H T, Yu J Z, Wang X B, zhang w, zhou t f, ao c. Study on physiological characters of new shoot in different cold-resistant tea varieties in autumn., 2014, 26(4): 925-928. (in Chinese)

[6] 李葉云, 龐磊, 陳啟文, 周月琴, 江昌俊. 低溫脅迫對茶樹葉片生理特性的影響. 西北農林科技大學學報(自然科學版), 2012, 40(4): 134-138.

Li Y Y, Pang L, Chen Q W, Zhou Y Q, Jiang C J. Effects of low temperature stress on physiological characteristics of tea leaves (L.)., 2012, 40(4): 134-138. (in Chinese)

[7] 孫海偉, 曹德航, 尚濤, 張虹, 劉靜, 謝忠琴, 王相濤. 茶樹抗寒育種及轉基因研究進展. 山東農業科學, 2013, 45(6): 119-122, 129.

Sun H W, Cao D H, Shang T, Zhang H, Liu J, Xie Z Q, Wang X T. Advances in research of cold-resistant breeding and transgene of tea plant., 2013, 45(6): 119-122, 129. (in Chinese)

[8] 張婷, 車鳳斌, 潘儼, 胡柏文, 許娟, 李萍. 低溫脅迫對核桃枝條幾個抗寒生理指標的影響. 新疆農業科學, 2011, 48(8): 1428-1433.

Zhang T, Che F B, Pan Y, Hu B W, Xu J, Li P. Influence of low temperature stress on several cold resistance indexes of the primary branches of walnuts., 2011, 48(8): 1428-1433. (in Chinese)

[9] 李葉云, 舒錫婷, 周月琴, 江昌俊. 自然越冬過程中3個茶樹品種的生理特性變化及抗寒性評價. 植物資源與環境學報, 2014, 23(3): 52-58.

Li Y Y, Shu X T, Zhou Y Q, Jiang C J. Change in physiological characteristics and cold resistance evaluation of three cultivars ofduring natural overwintering period., 2014, 23(3): 52-58. (in Chinese)

[10] 裴文, 李鵬, 裴海潮, 劉增喜, 楊秋生. 低溫條件下9種木蘭科植物抗寒性研究. 河南農業科學, 2014, 43(4): 101-105.

Pei W, Li P, Pei H C, Liu Z X, Yang Q S. Comparative analysis of physiological index related to cold resistance of nine magnoliaceae plants under natural and artificial low temperature conditions., 2014, 43(4): 101-105. (in Chinese)

[11] 田野, 王夢馨, 王金和, 韓寶瑜. 茶鮮葉可溶性糖和氨基酸含量與低溫的相關性. 茶葉科學, 2015, 35(6): 567-573.

Tian Y, Wang M X, Wang J H, Han B Y. Correlation of low temperature with soluble sugar and amino acid content in fresh tea leaves., 2015, 35(6): 567-573. (in Chinese)

[12] 林平, 趙東. 平陽特早茶研究. 茶葉, 1998, 24(4): 200-204.

Lin P, Zhao D. A study of Pingyang Tezaocha (L.)., 1998, 24(4): 200-204. (in Chinese)

[13] 楊亞軍, 楊素娟, 曾建明, 孫濤, 王玉書. 茶樹新品種中茶102選育研究報告. 中國茶葉, 2004(6): 14-15.

Yang Y J, Yang S J, Zeng J M, Sun T, Wang Y S. A study of Zhongcha 102 (L.)., 2004(6): 14-15. (in Chinese)

[14] 陳宗懋. 中國茶葉大辭典. 北京: 中國輕工業出版社, 2000: 117.

Chen Z M.. Beijing: China Light Industry Press, 2000: 117. (in Chinese)

[15] LASTDRAGER J, HANSON J, SMEEKENS S. Sugar signals and the control of plant growth and development., 2014,65(3): 799-807.

[16] QAYYUM A. Water stress causes differential effects on germination indices, total soluble sugar and proline content in wheat (L.) genotypes., 2011, 10(64): 14038-14045.

[17] MA Y Y, ZHANG Y L, LU J, SHAO H B. Roles of plant soluble sugars and their responses to plant cold stress., 2009, 8(10): 2004-2010.

[18] 駱耀平. 茶樹凍害的發生及防御. 中國茶葉, 2008(1): 30-31.

Luo Y P. Introduction to frozen injury of tea plants and their prevention measures., 2008(1): 30-31. (in Chinese)

[18] 邱乾棟, 呂曉貞, 臧德奎, 張雷, 張立才, 杜淑輝. 植物抗寒生理研究進展. 山東農業科學, 2009, 8: 53-57.

Qiu Q D, Lv X Z, Zang D K, Zhang L, Zhang L C, Du S H. Research progress on plant physiology of cold resistance., 2009, 8: 53-57. (in Chinese)

[20] Yue C, Cao H L, Wang L. Effects of cold acclimation on sugar metabolism and sugar-related gene expression in tea plant during the winter season., 2015, 88(6): 591-608.

[21] 朱政, 蔣家月, 江昌俊, 李雯. 低溫脅迫對茶樹葉片SOD、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響. 安徽農業大學學報, 2011, 38(1): 24-26.

Zhu Z, Jiang J Y, Jiang C J, Li W. Effect of low temperature stess on SOD activity, soluble protein content and soluble sugar content inleaves., 2011, 38(1): 24-26. (in Chinese)

[22] 趙明明, 周余華, 彭方仁, 郝明灼, 梁有旺, 任鶯, 華宏. 低溫脅迫下冬青葉片細胞內Ca2+水平及可溶性糖含量的變化. 南京林業大學學報(自然科學版), 2013, 37(5): 1-5.

Zhao M M, Zhou Y H, Peng F R, Hao M Z, Liang Y W, Ren Y, Hua H. Changes of Ca2+level and soluble sugar content in cells ofL. leaflets under low temperature stress., 2013, 37(5): 1-5. (in Chinese)

[23] 姚遠, 閔義, 胡新文, 李開綿, 郭建春. 低溫脅迫對木薯幼苗葉片轉化酶及可溶性糖含量的影響. 熱帶作物學報, 2010, 31(4): 556-560.

Yao Y, Min Y, Hu X W, Li K M, Guo J C. Effect of low temperature stress on the activity of invertase and soluble sugar content in leaves of Cassava seedlings., 2010, 31(4): 556-560. (in Chinese)

[24] Sagisaka S, Araki T. Amino acid pools in perennial plants at the wintering stage and at the beginning of growth., 1983, 24(3): 479-494.

[25] Delauney A J, Verma D P S. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants., 1993, 4(2): 215-223.

[26] 羅丹, 張喜春, 田碩. 低溫脅迫對番茄幼苗脯氨酸積累及其代謝關鍵酶活性的影響. 中國農學通報, 2013, 29(16): 90-95.

Luo D, Zhang X C, Tian S. Effect of low temperature stress on proline accumulation and the activities of the key enzymes involved in the proline metabolism in leaves of tomato seedling., 2013, 29(16): 90-95. (in Chinese)

[27] 陳璇, 李金耀, 馬紀, 張富春. 低溫脅迫對春小麥和冬小麥葉片游離脯氨酸含量變化的影響. 新疆農業科學, 2007, 44(5): 553-556.

Chen X, Li J Y, Ma J, Zhang F C. Effect of low temperature stress on change of free proline content in the leaves of spring and winter wheat., 2007, 44(5): 553-556. (in Chinese)

[28] 楊亞軍, 鄭雷英, 王新超. 冷馴化和ABA對茶樹抗寒力及其體內脯氨酸含量的影響. 茶葉科學, 2004, 24(3): 177-182.

Yang Y J, Zheng L Y, Wang X C. Effect of cold acclimation and ABA on cold hardiness, contents of proline in tea plants., 2004, 24(3): 177-182. (in Chinese)

[29] BORGO L, MARUR C J, Vieira L G E. Effects of high proline accumulation on chloroplast and mitochondrial ultrastructure and on osmotic adjustment in tobacco plants., 2015, 37(2): 153-175.

[30] Lü B S, MA H Y, LI X W, Wei, Li X, Lü H Y, YANG H Y, JIANG C J, LIANG Z W. Proline accumulation is not correlated with saline-alkaline stress tolerance in rice seedlings., 2015, 107(1): 51-60.

[31] 梁鎖興, 孟慶仙, 石美娟, 羅鋼鐵, 王貴珠. 平歐榛枝條可溶性蛋白及可溶性糖含量與抗寒性關系的研究. 中國農學通報, 2015, 31(13): 14-18.

Liang S X, Meng Q X, Shi M J, Luo G T, Wang G Z. Reasearch on relationship between cold-resistance and soluble protein and sugar of×branches., 2015, 31(13): 14-18. (in Chinese)

[32] 龔明, 劉友良, 朱培仁. 低溫下稻苗葉片中蛋白質及游離氨基酸的變化. 植物生理學通訊, 1989(4): 18-22.

Gong M, Liu Y L, Zhu P R. Changes of proteins and free amino acids in leaves of rice seedlings during chilling stress., 1989(4): 18-22. (in Chinese)

[33] KOVACS Z, Simon-Sarkadi L, Sovany C, Kirsch K, Galiba G, Kocsy G. Differential effects of cold acclimation and abscisic acid on free amino acid composition in wheat., 2011, 180(1): 61-68.

[34] 郭湘, 唐茜, 許燕, 陳玖琳, 王自琴. 早春霜凍對不同茶樹品種芽葉的生化成分及制茶品質的影響. 云南大學學報(自然科學版), 2015(6): 930-938.

Guo X, Tang Q, Xu Y, Chen J L, Wang Z Q. Effect of frost in early spring on biochemical composition and sensory quality of new shoots in different tea cultivars., 2015(6): 930-938. (in Chinese)

[35] 林鄭和, 鐘秋生, 陳常頌. 茶樹抗性育種研究進展. 福建茶葉, 2015(4): 2-4.

Lin Z H, Zhong Q S, Chen C S. Research progress on resistance breeding of tea plant., 2015(4): 2-4. (in Chinese)

[36] 韓寶瑜, 章正和, 房國賓, 黃安智. 茶樹益微增強茶樹抗寒和復壯效能的試驗研究. 茶葉, 1996, 12(1): 18-19.

Han B Y, Zhang Z H, Fang G B, Huang A Z. Study on enhancing cold-resistant of tea plant by tea beneficial microbes., 1996, 12(1): 18-19. (in Chinese)

（責任編輯 李莉）

Evaluation on Correlations of Three Kinds of Osmoregulation Substances in Tea Fresh Leaves with Low Temperature during Winter and Spring Respectively and Their Difference among Cultivars

BO Xiao-pei1, WANG Meng-xin1, CUI Lin1, WANG Jin-he2, HAN Bao-yu1

(1Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine, China Jiliang University, Hangzhou 310018;2Jiangsu Yinchunbiya Tea Co. Ltd, Danyang 212345, Jiangsu)

【Objective】 The content dynamics of three types of osmoregulation substances in fresh leaves of two cultivars of tea plants and their correlations with air temperatures during winter and early spring were investigated, to evaluate the differences in their responsiveness to the low temperature between the two tea cultivars. 【Method】 Two early bud tea cultivars, ‘Pingyangtezao’ and ‘Zhongcha 102’, were chosen, and air temperatures around their tea shoots were recorded every day from Oct. 21 to April 5 for two consecutive years. The temperature of the dry and wet bulb thermometer at 8:00, 14:00 and 20:00 was daily recorded, and the average of the three dry bulb thermometers set in the experimental tea plantations three times per day standard for the temperature of tea shoot habitat. During these two testing periods adult tea leaves of each cultivar were sampled on the fifth, fifteenth and twenty-fifth days of each month. The soluble sugar contents in the tea fresh leaves were measured by anthrone colorimetric method, the remaining clean fresh leaves were processed into the steamed green tea samples, whereas the contents of proline and free amino acids were determined by SDE-HPLC method. 【Result】The test phase was divided into two stages, the overwintering period (2013/10/21-2014/3/52014/10/21-2015/3/5) and early spring period (2014/3/6-2014/4/52015/3/6-2015/4/5) according to the developmental threshold temperature and the dormancy temperature of the tea plant. Accompanied with initial gradual drops and then maintaining at low air temperatures during the two winters (2013/10/21-2014/3/5, 2014/10/21-2015/3/5), the soluble sugar contents in fresh tea leaves of the two cultivars increased continuingly, negatively correlated with the 10-day average air temperatures. The proline contents increased first and then kept at a high level, also negatively correlated with the 10-day average air temperatures. The free amino acid contents dropped first and then stayed at a low level, which was positively correlated with the 10-day average air temperatures. When the temperature appeared the lowest value, the content of soluble sugars and the content of proline also correspondingly appeared the highest values subsequently, then the content of free amino acids also correspondingly appeared the lowest value. When the temperature was the highest value, the content of soluble sugar and the content of proline also correspondingly appeared the lowest value later, the content of the free amino acids also correspondingly appeared the highest value soon afterwards. During the two spring seasons (2014/3/6-2014/4/5, 2015/3/6-2015/4/5), as air temperatures increased gradually, the soluble sugar contents decreased, while the proline and the free amino acid contents appeared to increase.The frost-resistance of tea plant closely related with air temperature, and soluble sugar, the contents of proline and free amino acids in tea leaves closely related with the frost-resistance of tea plants. During the two winter seasons, compared with ‘Zhongcha 102’, when suffered from the low temperature stress in winter, the content of each of three kinds of osmoregulation substances of ‘pingyangtezao’ more sensitively responsed to low temperature than ‘Zhongcha 102’, and the contents of the three kinds of substances in cultivar ‘pingyangtezao’ were slightly high. 【Conclusion】 Tea plants are vulnerable to frost, freeze and the late spring coldness from late autumn to Qingming Festival. As important cold-resisting indices of tea plants, the contents of soluble sugars, proline and the free amino acids varied sensitively in responses to the low temperatures, and showed significant correlations with the 10-day average air temperatures during the winter and early spring seasons. The responsiveness of cultivar ‘Pingyangtezao’ to the low temperatures was greater than that of cultivar ‘Zhongcha 102’.

low temperature;L.; cold damage; soluble sugar; proline; free amino acids

2016-03-14；接受日期：2016-05-23

國家“863”計劃（2012AA10A508）

薄曉培，E-mail：514451641@qq.com。通信作者韓寶瑜，Tel：0571-86835706；E-mail：han-insect@263.net