葡萄OVATE基因家族生物信息學及表達

袁 月，張亞光，高世敏，陶建敏

?

葡萄基因家族生物信息學及表達

袁 月，張亞光，高世敏，陶建敏

（南京農業大學園藝學院，南京210095）

【目的】OVATE是一類調控植物生長發育的轉錄抑制因子，對葡萄基因家族（）進行生物信息學和組織特異性表達分析，為該類基因的功能研究奠定基礎。【方法】根據OVATE保守域蛋白序列（PF04844）對葡萄基因家族進行鑒定，利用生物信息學方法對葡萄基因家族染色體定位、基因結構、保守結構域、亞細胞定位等方面進行預測和分析，并分析葡萄和擬南芥基因家族的進化關系。采用實時熒光定量PCR技術檢測組織表達特性。【結果】葡萄基因家族包含17個成員，不均勻地分布在11條染色體上，均沒有內含子結構，編碼115—444個氨基酸，等電點4.55—9.69，均為親水蛋白；所有蛋白均包含完整的OVATE保守結構域，亞細胞定位主要在細胞核中。根據進化樹拓撲結構，將葡萄和擬南芥OVATE蛋白家族聚為六類(I—VI)，其中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ類僅包含兩個基因，Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ類中和相互交錯地聚類在一起；和共包含10個未知基序，保守元件1和2位于OVATE結構域區域，此外，在OVATE結構域外每個類別均包含特有基序。具有組織表達特異性，12個基因在根、莖、葉、花和果實中均可以檢測到表達，其余5個基因僅在特定組織中表達。多數在根、嫩莖和花中表達量較高，在嫩葉和果實中僅檢測到少數基因表達；在不同發育期表達量存在差異，通常在開花前1周和開花期表達量較高，而花后4周果實中表達量較低。1對旁系同源基因表達模式相似，3對旁系同源基因產生了新的表達模式。【結論】葡萄OVATE結構域序列比較保守，其在不同組織中呈現出多種表達模式，推測其可能參與了葡萄生長發育的調控。

葡萄;基因家族；生物信息學；表達

0 引言

【研究意義】OVATE是一類植物轉錄因子[1-5]，調控植物生長發育的多個方面，包括胚囊和花粉發育[1]、次生細胞壁合成[5]以及果實形狀[6-7]等。葡萄（L.）具有5 000多年的栽培歷史[8]，其保留著古老的開花植物的基因組結構，是非常有用的模式植物[9]。對葡萄基因家族進行生物信息學分析，對于葡萄功能基因組學的研究發展有重要意義。【前人研究進展】LIU等[6]首次在番茄中克隆出，研究發現其能夠控制番茄果實形狀，該基因的一個點突變導致翻譯提前終止，使得野生番茄果實縱徑增長，頸部生長受到限制，從而由圓形果實發育成梨形果實。編碼一個親水蛋白，該蛋白的C末端結構域DUF623在擬南芥、水稻和番茄中具有保守性，被命名為OVATE結構域，凡含有該結構域的蛋白，均屬于OVATE蛋白家族。目前關于OVATE蛋白家族的研究主要集中在擬南芥、番茄和水稻中，其中，擬南芥基因組中共被鑒定出18個OVATE蛋白，功能分析表明這些蛋白作為轉錄抑制因子，調控植株生長發育的多個過程[3,5]。在酵母雙雜交試驗中，9個OVATE蛋白被發現與TALE同源異型盒蛋白相互作用，且AtOFP1和AtOFP5共同調控一個TALE同源異型盒蛋白BLH1的亞細胞定位，當這兩個基因在煙草葉片中共表達時，BLH1蛋白從細胞核運輸到細胞質中[1]。TALE同源異型盒蛋白包含一個三氨基酸殘基環連接兩個螺旋的結構[10]，分為KNOX和BELL兩個子類[11-13]，KNOX和BELL蛋白相互作用形成異源二聚體，調控植物的生長發育[14-18]，因此，擬南芥OVATE蛋白可以通過與TALE蛋白相互作用而間接調控植物生長發育，不僅如此，OVATE蛋白還可以直接調控靶基因的表達。是赤霉素合成關鍵酶基因，染色質免疫共沉淀表明該基因是AtOFP1蛋白的靶基因，AtOFP1通過抑制該基因的表達，調控赤霉素的生物合成，從而導致包括蓮座葉、下胚軸、莖葉、花序梗、花器官和角果在內的地上部器官變短，該家族其他基因的過表達也具有相似的生理效應[3]。此外，沉默、、、、和中任一個基因，植株的表型并未發生變化，表明這些家族成員間存在功能冗余[4]。AtOFP1還與AtKu70相互作用，參與DNA非同源末端修復[19]。AtOFP4能夠與KNAX7蛋白的相互作用，進而調控次生細胞壁的形成[5]。AtOFP5通過抑制BLH1-KNAT3復合物活性在胚囊的發育早期發揮作用[2]。在番茄全基因組中共預測了31個家族基因，其中和在生殖器官中的表達量高于營養器官，而和在苗期的根、幼葉和下胚軸中表達量較高，表明番茄家族成員在植株發育調控中發揮著不同的作用[20]。在水稻的基因組中共預測出31個家族基因，這些基因同樣具有組織表達特異性，接近一半的基因在苗期表達量較高；外施油菜素內酯可以顯著影響和的表達[21]。辣椒OVATE蛋白家族成員CaOVATE也是通過抑制表達，從而改變果實形狀[7]。香蕉OVATE蛋白家族成員MaOFP1與香蕉MuMADS1蛋白存在互作，兩者共同調控香蕉果實的發育，在香蕉果實發育前期表達量較高，后期表達則受到乙烯的抑制[22]。在最近的研究[23]中，包含擬南芥、水稻、番茄在內的13種植物基因家族被鑒定出來，共有265個OVATE蛋白序列，這些物種包含較古老的苔蘚和石松門植物，生物信息學分析表明，基因家族存在不同的進化機制，主要為保守進化和分散擴增兩種方式。【本研究切入點】目前，僅有一篇外文文獻報道葡萄全基因組中包含9個家族成員，鑒定出的基因數目較少，且未詳細地進行生物信息學和表達分析，因此，有必要對葡萄基因家族進行全面鑒定和分析。【擬解決的關鍵問題】在葡萄全基因組中搜索鑒定基因家族成員，全面分析基因結構、染色體定位、蛋白保守結構域及系統發育等信息，同時研究葡萄基因家族的組織表達特征，為進一步探究基因功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為二倍體‘寶滿’葡萄，種植于南京農業大學園藝學院湯山葡萄基地，以每個花序一半以上的小花開放作為開花期，分別于2015年5月5日（花前一周）采集花蕾，5月12日（開花期）采集開放的小花（含花冠和花藥），6月12日（花后四周）采果實，采集新稍上完全展開的嫩葉和嫩莖。根取自組培苗，組培苗由南京農業大學園藝學院果樹生物技術實驗室培養，培養條件是光照時間16 h，光照強度2 000 lx，培養溫度25℃。材料用液氮速凍后，保存于-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 葡萄和擬南芥基因家族的鑒定 擬南芥全基因組的注釋序列在NCBI（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/）中下載，葡萄全基因組注釋序列分別在Grape Genome[9]（http://genomes.cribi.unipd.it/grape/）和NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載，在Pfam數據庫[24]（http://pfam.xfam.org/）中下載葡萄和擬南芥OVATE蛋白保守域序列（PF04844），利用Bioedit軟件在葡萄和擬南芥的蛋白組中搜索這些序列的同源蛋白，刪除重復序列，將得到的序列在Pfam上搜索，去除沒有OVATE保守域的序列，最終獲得葡萄和擬南芥家族基因。

1.2.2 葡萄基因家族的生物信息學分析 利用在線網站EXPASY（http://web.expasy.org/protparam/）中ProtParam工具[25]對葡萄OVATE家族蛋白的氨基酸組成、疏水性、等電點等理化性質進行分析；在NCBI上下載葡萄和擬南芥OVATE家族基因的CDS序列和基因組定位信息，利用在線軟件GSDS2.0[26]（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪出基因結構圖，并運用MapInspect工具進行染色體定位作圖；利用序列分析軟件 clustalX2.0，Jalview2.8和在線軟件WebLogo3[27]（http://weblogo.threeplusone.com/）分析葡萄OVATE家族蛋白的OVATE保守結構域序列；使用在線軟件CelloV.2.5[28]（http://cello.life.nctu.edu. tw/），WOLF PSORT（http://www.genscript.com/wolf- psort.html），以及在線網站Soft Berry（http://linux1. softberry.com/berry.phtml）中的PROTCOMP程序共同對葡萄OVATE家族基因進行亞細胞定位預測，利用MEGA5.0[29]軟件對已鑒定的葡萄和擬南芥OVATE家族蛋白進行序列比對，并用鄰位（Neighbor-Joining）算法構建系統進化樹，進行Bootstrap測試，重復設置1 000；基序預測采用在線軟件MEME[30]（http://meme- suite.org/tools/meme），參數設置為：預測數目10，氨基酸數目4—70，位點數2—300。

1.2.3 葡萄基因家族表達分析 根據基因序列設計實時熒光定量PCR特異引物（表1），以葡萄（XM_002265440）作為內參基因，采用成都福際公司的多糖多酚植物組織總RNA提取試劑盒提取RNA，利用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA第一條鏈，稀釋后的cDNA用于實時熒光定量PCR。PCR采用20 μL反應體系：cDNA 1 μL，2×SYBR Premix EX TaqTM（TaKaRa）10 μL，上、下游引物各0.2 μL，滅菌后ddH2O 8.6 μL；反應程序：95℃預變性4 min；95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，40個循環。每個處理3次重復，采用ABI7300system軟件和2-ΔΔCT[31]方法分析數據。

表1 引物序列

2 結果

2.1鑒定及蛋白質理化性質分析

通過搜索葡萄全基因組數據庫，共鑒定出17個葡萄基因家族成員，根據其在染色體上的位置，依次命名為—。這些基因的編碼區長度在348—1 335 bp，編碼115—444個氨基酸，等電點在4.55—9.69，氨基酸序列的平均親水系數在-1.032—-0.283，均為負值，表明這些蛋白均為親水蛋白，但親水程度不同，詳見表2。

表2 葡萄OVATE家族基因信息和理化性質分析

2.2 VvOFPs的OVATE保守域的鑒定和分析

通過Pfam在線數據庫對候選的葡萄OVATE家族蛋白進行鑒定，所有候選基因在C末端均含有OVATE保守結構域，下載這些蛋白的OVATE結構域序列，利用clustalX2.0軟件進行序列比對，并使用Jalview2.8繪制并分析比對序列，WebLogo3創建保守域Logo，最終拼接得到圖1，由圖1可知，葡萄OVATE結構域序列比較保守，氨基酸數目在55—61，所有蛋白的OVATE結構域序列都比較完整，結合基序分析結果，基序1全部位點均在OVATE結構域區域，其中保守性強的氨基酸有亮氨酸（L35）、天冬酰胺（N43）、異亮氨酸（I51）及苯丙氨酸（F55）；基序2大部分位點位于結構域區域，其中保守性強的氨基酸有絲氨酸（S1，S11）、脯氨酸（P4）、蛋氨酸（M12）。

圖1 葡萄OVATE蛋白家族的保守結構域序列比對

2.3的染色體定位分析

葡萄家族的17個基因不均等地分布在11條染色體上，1、2、3、12、14、15、17、19號染色體上均沒有分布，其中，在6號和8號染色體上分布的基因最多，分別有3個基因；4號、10號染色體各分布2個基因；其余7條染色體均只含有1個基因。此外，6號染色體上的和及8號染色體上的和物理距離較近，分別為8.7和6.4 kb，以串聯的方式排列在染色體上（圖2）。

圖2 葡萄OVATE基因家族的染色體定位

2.4 VvOFPs的進化樹分析

構建葡萄和擬南芥OVATE蛋白家族系統進化樹（圖3-A），根據進化樹的拓撲結構對兩個物種OVATE家族蛋白進行聚類，可分為六類，分別是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。其中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ類所包含的基因較少，均只有兩個基因，均包含1個和1個，說明該分支內基因進化速度相對緩慢，推測其基因功能相對保守。Ⅰ類包含2個和4個，Ⅳ類包含5個和4個，Ⅵ類包含7個和7個，在Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ類中，和，和，和的親緣關系較近，可能具有相似的功能，其余和相互交錯地聚類在一起，形成了4對旁系同源基因對（），形成了4對旁系同源基因對（、、、）。

2.5 VvOFPs的基序分析

利用在線軟件MEME對葡萄和擬南芥OVATE家族的蛋白序列進行基序預測，結果表明，葡萄OVATE蛋白家族共包含10個未知基序（圖3-B）。每個蛋白序列的C末端均含有保守元件1和2，位于OVATE結構域區域，推測這兩個基序可能與OVATE結構域的功能相關，結合進化樹分析，Ⅴ類的基因僅有基序1和2，除Ⅰ和Ⅲ類之外，Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ類中也分別存在1—2個基因僅有這兩個基序。除基序1和2外，有些基序也在不同的類別中同時存在，如Ⅱ類中的1個基因與Ⅵ類中的4個基因共享基序7，Ⅳ類中的5個基因與Ⅰ類中的2個基因共享基序9；而有些基序是各類別所特有的，Ⅰ類中全部基因都共享保守元件3，該基序位于N末端DNA結合域中；Ⅲ類的兩個基因共享基序10；Ⅳ類中3個基因共享未知基序8；Ⅵ類中6個基因同時共享基序4、5和6，基序分析結果和進化樹分類結果基本一致。

基因登錄號分別是：AtOFP1，At5g01840；AtOFP2，At2g30400；AtOFP3，At5g58360；AtOFP4，At1g06920；AtOFP5，At4g18830；AtOFP6，At3g52525；AtOFP，At2g18500；AtOFP8，At5g19650；AtOFP9，T24H24.4；AtOFP10，At5g22240；AtOFP11，At4g14860；AtOFP12，At1g05420；AtOFP13，At5g04820；AtOFP14，At1g79960；AtOFP15，At2g36050；AtOFP16，At2g32100；AtOFP17，At2g36026；AtOFP18，At3g52540；系統發育樹樹枝上面或下面的數字代表自舉值

2.6的內含子和外顯子分析

利用Pfam數據庫中OVATE保守結構域序列對擬南芥全基因組序列進行BLAST，并在植物轉錄因子數據庫PlnTFDB（3.0）中搜索AtOFP9，共鑒定出18個家族基因，根據兩個物種的基因組和CDS序列，繪制兩個物種的基因結構圖。圖3-C表明擬南芥和葡萄家族基因均沒有內含子，此外，葡萄家族有兩個基因結構不完整，分別是缺少3′非編碼區，既缺少非5′編碼區，也沒有3′非編碼區；擬南芥家族只有6個基因包含完整的結構，、、、、、、和既缺少非5′編碼區，也沒有3′非編碼區，、和缺少5′非編碼區，缺少3′非編碼區。

2.7 VvOFPs的亞細胞定位

在3個亞細胞定位網站上分析葡萄OVATE蛋白家族，預測的結果存在差異（表3），其中在CelloV2.5 預測結果中，15個蛋白被定位在細胞核，VvOFP9被定位在葉綠體和細胞外，VvOFP5被定位在細胞膜和細胞外；根據WOLF PSORT 預測結果，17個蛋白被定位在細胞核，12個在線粒體，11個在葉綠體，9個在三者中均被定位，還有少數蛋白被定位在細胞外、細胞膜、內質網和高爾基體上；在PROTCOMP預測結果中，8個蛋白被定位在細胞核，其余7個蛋白被定為在細胞外。綜合分析預測結果，5個蛋白定位結果一致，定位在細胞核的分值最高，分別是VvOFP6、VvOFP7、VvOFP11、VvOFP13和VvOFP14，另外12個蛋白在兩種或一種定位方法中被定為在細胞核，這符合轉錄因子在細胞核中調控基因表達的作用特點。

表3 葡萄OVATE蛋白家族的亞細胞定位預測

nucl：細胞核，plas：質膜，extr：細胞外，cyto：細胞質，mito：線粒體，E.R.：內質網，chlo：葉綠體，golg：高爾基體。括號內的數值代表預測的綜合得分

nucl: nucleus, plas: plasma membrane, extr: extracellular, cyto: cytoplasm, mito: mitochondria, E.R.: endoplasmic reticulum, chlo: chloroplast, golg: golgi. The numbers in parenthesis mean the integral prediction scores of protein location

2.8家族基因在不同組織中表達分析

對葡萄基因家族在不同組織的表達結果（圖4）進行分析，表明這些基因具有組織表達特異性，12個基因在各個組織中均可以檢測到表達，其余基因、、、、僅在幾個組織中檢測到表達，且這5個基因集中在Ⅲ類和Ⅵ類。在根中表達量較高的是、、、、；在莖中表達量較高的是、、、、、；在花前1周的花蕾表達量較高的有、、、、、、、；在開花期的小花中表達量較高的有、、、。這些基因在葉片和花后4周的果實中表達量均較低。對比不同時期花和果實的表達量，可以發現全部基因在花后4周的果實中表達量均顯著下降，大部分基因花前1周花蕾中的表達量高于開花期，這說明葡萄OVATE家族基因對果實發育的調控在開花期及其前1周。此外，和這對旁系同源基因表達模式相似，主要在生殖器官中表達；而和，和，和，這3對旁系同源基因表達模式不同。

R：根，YS：嫩莖，YL：嫩葉，1BA：花蕾（花前1周），A：小花（開花期），4AA：果實（花后4周）；垂直線表示的是3個生物學重復相對表達量之間的正偏差

3 討論

本文利用Pfam數據庫中OVATE保守結構域序列對葡萄全基因組序列進行BLAST，共獲得葡萄基因家族成員17個，經過保守結構域分析鑒定，這些基因均屬于基因家族。LIU等[23]根據已報道的擬南芥OVATE蛋白序列以及番茄OVATE蛋白（AAN17752），在Phyzome和Genoscope兩個基因組網站上進行Blast，共獲得9個葡萄基因家族成員，比本文獲得的基因數少了8個。本文所鑒定的擬南芥基因家族成員與前人報道不盡相同，HACKBUSCH等[1]根據番茄OVATE蛋白結構域序列在擬南芥基因組數據庫TAIR（http://www.arabidopsis.org/）中進行BLAST，獲得18個，WANG等[4]發現（登錄號At4g04030）編碼的蛋白中缺少OVATE結構域，本文利用Pfam數據庫中OVATE保守結構域序列對擬南芥全基因組序列進行BLAST，只獲得了17個基因，缺少（登錄號At4g04030），在植物轉錄因子數據庫PlnTFDB（3.0）中查找到含有OVATE結構域的，將該蛋白序列在NCBI上BLAST，獲得相似度100%的序列（登錄號AF075598），該序列是通過細菌人工染色體克隆獲得，氨基酸數目為411個，而氨基酸數目僅為128個，兩個基因均位于4號染色體，存在部分重疊區域，因此，本研究認為即是。

葡萄和擬南芥均屬于雙子葉植物，前人研究[21,23]發現在單子葉植物的家族基因數目高于雙子葉植物，高等植物家族多數基因缺少內含子結構，其中帶有內含子的基因一般只有1個內含子，這可能是因為基因家族在進化過程中相對保守。本文對葡萄和擬南芥家族基因結構進行分析，發現兩個物種均沒有內含子結構。本研究根據葡萄和擬南芥基因家族的蛋白序列進行進化樹構建，并根據進化樹的拓撲結構分為6類，基序分析表明在OVATE結構域外，每個類別包含特有基序，這也同時驗證了分類結果。在多項OVATE蛋白家族聚類分析研究中也采用了此類方法[4,20-21,23]。LIU等[23]提出基因家族包括保守進化和發散擴增兩種進化機制，一方面有些分支每個物種僅有1—2個基因，這些基因在功能上相對保守，可能對植物的發育有著非常重要的作用；另一方面有些分支每個物種包含很多基因，這些基因在功能上發生了分化，擁有這個物種所特有的功能，本文也有類似的情況，如Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ類中僅包含兩個基因，可能發生了保守進化，產生相似的功能。

葡萄在生長發育過程中要經歷營養生長和生殖生長兩個時期，基因在不同發育期不同組織的表達特性反應了基因的功能，本研究表明葡萄基因家族在不同組織中特異表達，有些基因在某個組織中特異表達，例如只在花前一周和開花期檢測到表達，說明該基因可能在花中發揮調控作用；有些基因在生殖器官或營養器官中表達量較高，例如，在花中表達量較高，而在根、葉中表達量極少，推測該基因可能參與了葡萄生殖生長的調控；有些基因在各組織中表達量差異不大，如在葉、莖，花前1周和開花期的花中表達量差異不大，推測該基因可能調控葡萄生長發育的多個過程。對比擬南芥基因家族組織表達研究結果[4]，發現一些直系同源的葡萄和擬南芥家族基因也存在類似的表達特性，推測這些基因可能行使相似的功能，例如，和被檢測到在嫩莖中表達量較高和在花蕾中表達量較高和在根中被檢測到表達量較高。LIU等[23]研究發現番茄中旁系同源基因存在兩種表達模式，一種是保持復制前的功能，兩個基因具有相似的表達模式；另一類是兩個基因的功能發生了變異，其中1個基因保留著原始的功能，而另1個基因則產生了新的表達模式。本研究中也有類似的發現，如和這對旁系基因在生殖器官中的表達量較高；、與屬于直系同源基因，和在根中的表達量較高，而在根部的表達量很低，在花前1周的花蕾中表達量較高。

4 結論

通過分析葡萄基因家族的染色體定位、基因結構、亞細胞定位、保守域分析、系統進化和基序鑒定等多方面的生物學信息，較為系統地鑒定了葡萄基因家族，葡萄OVATE結構域序列比較保守；其在不同組織中呈現出多種表達模式，推測其可能參與了葡萄生長發育的調控。

References

[1] HACKBUSCH J, RICHTER K, MULLER J, SALAMINI F, UHRIG J F. A central role ofovate family proteins in networking and subcellular localization of 3-aa loop extension homeodomain proteins., 2005, 102(13): 4908-4912.

[2] PAGNUSSAT G C, YU H J, SUNDARESAN V. Cell-fate switch of synergid to egg cell inmutant embryo sacs arises from misexpression of the BEL1-like homeodomain gene., 2007, 19(11): 3578-3592.

[3] WANG S, CHANG Y, GUO J, CHEN J G.ovate family protein 1 is a transcriptional repressor that suppresses cell elongation., 2007, 50(5): 858-872.

[4] WANG S, CHANG Y, GUO J, ZENG Q, ELLIS B E, CHEN J G.ovate family proteins, a novel transcriptional repressor family, control multiple aspects of plant growth and development., 2011, 6(8): e23896.

[5] LI E, WANG S, LIU Y, CHEN J G, DOUGLAS C J. OVATE FAMILY PROTEIN4 (OFP4) interaction with KNAT7 regulates secondary cell wall formation in., 2011, 67(2): 328-341.

[6] LIU J, VAN ECK J, CONG B, TANKSLEY S D. A new class of regulatory genes underlying the cause of pear-shaped tomato fruit., 2002, 99(20): 13302-13306.

[7] TSABALLA A, PASENTSIS K, DARZENTAS N, TSAFTARIS A S. Multiple evidence for the role of angene in determining fruit shape in pepper., 2011, 11: 46.

[8] 陳杰忠. 果樹栽培學各論. 北京: 中國農業出版社, 2011.

CHEN J Z.. Beijing: China Agriculture Press, 2011. (in Chinese)

[9] VITULO N, FORCATO C, CARPINELLI E C, TELATIN A, CAMPAGNA D, D'ANGELO M, ZIMBELLO R, CORSO M, VANNOZZI A, BONGHI C, LUCCHIN M, VALLE G. A deep survey of alternative splicing in grape reveals changes in the splicing machinery related to tissue, stress condition and genotype., 2014, 14: 99.

[10] BERTOLINO E, REIMUND B, WILDT-PERINIC D, CLERC R G. A novel homeobox protein which recognizes a TGT core and functionally interferes with a retinoid-responsive motif., 1995, 270(52): 31178-31188.

[11] HAY A, TSIANTIS M. A KNOX family TALE., 2009, 12(5): 593-598.

[12] HAMANT O, PAUTOT V. Plant development: a TALE story., 2010, 333(4): 371-381.

[13] HAY A, TSIANTIS M. KNOX genes: versatile regulators of plant development and diversity., 2010, 137(19): 3153-3165.

[14] BELLAOUI M, PIDKOWICH M S, SAMACH A, KUSHALAPPA K, KOHALMI S E, MODRUSAN Z, CROSBY W L, HAUGHN G W. TheBELL1 and KNOX TALE homeodomain proteins interact through a domain conserved between plants and animals., 2001, 13(11): 2455-2470.

[15] SMITH H M, HAKE S. The interaction of two homeobox genes,and, regulates internode patterning in theinflorescence.2003, 15(8): 1717-1727.

[16] SMITH H M, BOSCHKE I, HAKE S. Selective interaction of plant homeodomain proteins mediates high DNA-binding affinity., 2002, 99(14): 9579-9584.

[17] CHEN H, BANERJEE A K, HANNAPEL D J. The tandem complex of BELL and KNOX partners is required for transcriptional repression of., 2004, 38(2): 276-284.

[18] COLE M, NOLTE C, WERR W. Nuclear import of the transcription factor SHOOT MERISTEMLESS depends on heterodimerization with BLH proteins expressed in discrete sub-domains of the shoot apical meristem of., 2006, 34(4): 1281-1292.

[19] WANG Y K, CHANG W C, LIU P F, HSIAO M K, LIN C T, LIN S M, PAN R L. Ovate family protein 1 as a plant Ku70 interacting protein involving in DNA double-strand break repair., 2010, 74(4/5): 453-466.

[20] HUANG Z, VAN HOUTEN J, GONZALEZ G, XIAO H, VAN DER KNAAP E. Genome-wide identification, phylogeny and expression analysis of,andgene family in tomato., 2013, 288(3/4): 111-129.

[21] YU H, JIANG W, LIU Q, ZHANG H, PIAO M, CHEN Z, BIAN M. Expression pattern and subcellular localization of the ovate protein family in rice., 2015, 10(3): e118966.

[22] LIU J, ZHANG J, HU W, MIAO H, ZHANG J, JIA C, WANG Z, XU B, JIN Z. Banana Ovate family protein MaOFP1 and MADS-box protein MuMADS1 antagonistically regulated banana fruit ripening., 2015, 10(4): e123870.

[23] LIU D, SUN W, YUAN Y, ZHANG N, HAYWARD A, LIU Y, WANG Y. Phylogenetic analyses provide the first insights into the evolution of OVATE family proteins in land plants., 2014, 113(7): 1219-1233.

[24] FINN R D, COGGILL P, EBERHARDT R Y, EDDY S R, MISTRY J, MITCHELL A L, POTTER S C, PUNTA M, QURESHI M, SANGRADORVEGAS A. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future., 2015, 44(Database issue): D279-D285.

[25] WALKER J M.. Humana Press, 2005.

[26] HU B, JIN J, GUO A Y, ZHANG H, LUO J, GAO G. GSDS 2.0: an upgraded gene feature visualization server., 2014, 31(8): 1296.

[27] CROOKS G E, HON G, CHANDONIA J M, BRENNER S E. WebLogo: a sequence logo generator., 2004, 14(6): 1188-1190.

[28] CHIN-SHENG Y, YU-CHING C, CHIH-HAO L, JENN-KANG H. Prediction of protein subcellular localization., 2006, 64(3): 643-651.

[29] TAMURA K, PETERSON D, PETERSON N, STECHER G, NEI M, KUMAR S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods., 2011, 28(10): 2731-2739.

[30] BAILEY T L, MIKAEL B, BUSKE F A, MARTIN F, GRANT C E, LUCA C, JINGYUAN R, LI W W, NOBLE W S. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching., 2009, 37(Suppl2): W202-W208.

[31] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta delta C(T)) method., 2001, 25(4): 402-408.

（責任編輯 趙伶俐）

Bioinformatics and Expression of theGene Family in Grape

YUAN Yue, ZHANG Ya-guang, GAO Shi-min, TAO Jian-min

(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

【Objective】OVATE is a class of transcriptional repressor that regulates plant growth and development. In this study, the authors analyzed the grapegene family () from the aspects of bioinformatics and tissue-specific expression in order to lay a foundation for the functional studies in future. 【Method】Based on the conserved OVATE domain (PF04844),genes were identified from grape genome. Chromosome location, gene structure, conserved domain and subcellular localization were also analyzed by the bioinformatics methods. A phylogenetic analysis was conducted based on the alignment of the OVATE proteins from grape andgenomes. The expression patterns ofwere tested via quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). 【Result】Seventeen putativewere identified in the grape genome and they unevenly distributed on the eleven chromosomes. No intron was found in the gene structures of. Theencoded hydrophilic proteins, containing 115-444 amino acids, and their isoelectric points ranged from 4.55-9.69. In addition, all the VvOFPs contained the entire OVATE domain and were predicted to be located in the nucleus. According to the topology of phylogenetic tree, OVATE proteins from grape andwere divided into six groups (I-VI). Group II, III and V contained only two members, whilst members of groups I, IV and VI were clustered in the species-specific pattern. VvOFPs and AtOFPs contained 10 uncharacterized motifs. Motifs 1 and 2 were located in the OVATE domain region. Besides, group-specific motifs were also found outside the OVATE domain. qRT-PCR analysis showed thatexhibited different tissue-specific expression patterns. Interestingly, twelvewere found to be expressed in the detected organs of roots, stems, leaves, flowers and fruits while the others were expressed in the specific organ tissues. Most of thewere more highly expressed in roots, stems and flowers, whereas a little gene was detected with low level in leaves and fruits. Meanwhile,expressed differently at different developmental stage. Transcripts in flowers a week before or at anthesis were at a high level, while low in fruits four weeks after anthesis. In addition, one pair of paralogues exhibited the same expression patterns, whereas the other three pairs of paralogues exhibited divergent expression patterns. 【Conclusion】Results of this study showed that grape OVATE domain is conserved.exhibited different expression patterns and may be involved in regulation of plant growth and development.

grape;gene family; bioinformatics; expression

2016-03-16；接受日期：2016-06-07

國家現代農業葡萄產業技術體系項目（CARS-30）、國家“948”重點項目（2016-X19）、淮安科技局葡萄新品種引進及設施栽培技術研究與應用項目（HAC2014019）、江蘇省科技廳設施條件下葡萄高效栽培新技術研究與應用項目（SBE2014030811）

袁月，Tel：15150536081；E-mail：2013104040@njau.edu.cn。通信作者陶建敏，Tel：13905160976，E-mail：tjm266@sina.com