中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白基因AcerOBP14的克隆及時空表達(dá)

杜亞麗，張中印，潘建芳，王樹杰，楊 爽, 3，趙慧婷，姜玉鎖

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中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白基因的克隆及時空表達(dá)

杜亞麗1，張中印2，潘建芳1，王樹杰1，楊 爽1, 3，趙慧婷4，姜玉鎖1

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101；4山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

【目的】克隆獲得中華蜜蜂（）基因序列，并對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，分析其在不同組織和發(fā)育階段的時空表達(dá)差異，為該基因的功能研究提供參考。【方法】以中華蜜蜂全組織cDNA為模板利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增和克隆獲得cDNA全長序列，并提交至GenBank數(shù)據(jù)庫；利用多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析其編碼蛋白的理化特性和結(jié)構(gòu)特征；采用MEGA5.2軟件中的鄰位相連法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建AcerOBP14及其同源膜翅目昆蟲OBPs的系統(tǒng)發(fā)育樹；通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析在1、5、10、15、20、25和30日齡中華蜜蜂不同組織（觸角、頭、胸、腹、足和翅）中mRNA的表達(dá)情況。【結(jié)果】克隆獲得了中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白基因的cDNA序列（GenBank登錄號為KT24648）。的開放閱讀框（ORF）長度為408 bp，編碼135個氨基酸，預(yù)測其蛋白分子量為15.08 kD，理論等電點(diǎn)為5.44，有信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)，且第18—127位氨基酸之間存在一個昆蟲氣味結(jié)合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守結(jié)構(gòu)域；存在多個比較明顯的疏水區(qū)域，可能是脂溶性氣味分子的結(jié)合位點(diǎn)；含有4個保守的半胱氨酸位點(diǎn)，屬于Minus-C OBP亞家族。亞細(xì)胞定位分析表明，AcerOBP14屬于分泌型蛋白，主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-質(zhì)膜分泌途徑上。AcerOBP14蛋白具有7個螺旋，1—6屬于典型OBPs核心螺旋，7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比對結(jié)果顯示，AcerOBP14與西方蜜蜂AmelOBP14的氨基酸序列一致性最高，達(dá)到86%；其次是大蜜蜂AdorGOBP56a-like，一致性為55%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，同為蜜蜂屬的中華蜜蜂AcerOBP14、西方蜜蜂AmelOBP14、大蜜蜂AdorGOBP56a-like、中華蜜蜂AcerOBP21和小蜜蜂AfloGOBP56d-like聚為一個分支，切葉蜂屬的苜蓿切葉蜂MrotGOBP56a-like、側(cè)溝繭蜂屬的毀側(cè)溝繭蜂MdemGOBP83a-like、壁蜂屬的角額壁蜂OcorOBP3和熊蜂屬的BterGOBP56d-like和BimpGOBP56d-like聚為另一大分支。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在成蜂不同發(fā)育期的觸角、頭、胸、腹、足和翅中均有表達(dá)，其表達(dá)程度有差異。1日齡工蜂的胸部表達(dá)量最高，觸角次之，且兩者均極顯著高于頭、腹、足和翅（＜0.01）；其他日齡工蜂觸角表達(dá)量均極顯著高于其他組織（＜0.01），其中20日齡工蜂的觸角表達(dá)量最高。從各組織在不同發(fā)育階段的表達(dá)量來看，觸角的表達(dá)量在1日齡最低，極顯著地低于其他日齡（＜0.01）；5、10日齡逐漸增加，15日齡突然下降，20日齡達(dá)到最高，極顯著高于其他日齡（＜0.01）；之后又呈逐漸下降趨勢。頭、胸、腹、足和翅膀表達(dá)量總體上隨日齡增加而呈下降趨勢，5日齡之后大幅下降，之后趨于平穩(wěn)且呈低豐度表達(dá)。【結(jié)論】AcerOBP14屬于Minus-C OBP亞家族，具有PBP-GOBP家族的典型結(jié)構(gòu)；組織表達(dá)譜結(jié)果暗示，AcerOBP14屬普通氣味結(jié)合蛋白GOBP，在中華蜜蜂中除嗅覺識別之外還參與其他生理功能。

中華蜜蜂；；基因克隆；生物信息學(xué)；時空表達(dá)

0 引言

【研究意義】昆蟲生存與繁殖的相關(guān)行為在很大程度上依賴于自身的嗅覺系統(tǒng)。昆蟲嗅覺系統(tǒng)是一個高度復(fù)雜和極其靈敏的感受系統(tǒng)，能夠探測數(shù)以萬計(jì)的揮發(fā)性氣味分子，即使在濃度很低的情況下，也可以辨別僅有一個或幾個原子不同的氣味物質(zhì)[1]。嗅覺識別過程中，氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）最先與外界脂溶性氣味物質(zhì)發(fā)生生化反應(yīng)，在昆蟲與外界進(jìn)行信息交流的過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。中華蜜蜂（）作為中國原有的蜜蜂當(dāng)家品種，有嗅覺靈敏、采集力強(qiáng)、善于利用零星蜜源植物、抗逆抗病能力強(qiáng)等意大利蜜蜂無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，非常適合在中國的山林地區(qū)定地飼養(yǎng)。對中華蜜蜂OBPs的研究，不僅可以明確其嗅覺識別機(jī)制，還能夠?yàn)榭茖W(xué)飼養(yǎng)管理、蜜蜂病害防治提供理論指導(dǎo)。【前人研究進(jìn)展】OBPs是一類以極高的濃度存在于嗅覺受體周圍淋巴液中的水溶性蛋白，一般由130—220個氨基酸組成，分子量介于10—30 kD，等電點(diǎn)多在4.4—5.2[4]。OBPs在N末端有一段20多個氨基酸殘基的信號肽序列，典型的特征是含有6個保守的半胱氨酸（Cys）位點(diǎn)，兩兩配對形成3對二硫鍵[5-7]。自1981年在鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)第一個昆蟲氣味結(jié)合蛋白以來，已在11個目的50多種昆蟲中鑒定出了800多個OBPs。OBPs的數(shù)量在不同種類昆蟲中差異較大，如在黑腹果蠅（）、西方蜜蜂（）、赤擬谷盜（）、家蠶（）、椰甲截脈姬小蜂（）中已分別鑒定出51、21、46、44、8個OBPs[8-12]。根據(jù)保守半胱氨酸的數(shù)目分為Classical OBPs、Plus-C OBPs（8個保守的Cys和1個Pro位點(diǎn)）、Minus-C OBPs（只有4個保守的Cys）、Atypical OBPs（9—10個Cys位點(diǎn)和長的C末端）和Dimer OBPs（由兩組6個保守的半胱氨酸形成二聚體）[13-16]。據(jù)報道，Minus-C OBPs可能是Classical OBPs、Plus-C OBPs等的祖先基因[17]。早期研究認(rèn)為OBPs特異地表達(dá)于昆蟲觸角中，特別是性信息素結(jié)合蛋白PBPs主要表達(dá)于雄性昆蟲的觸角[18-20]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)OBPs并非只表達(dá)和分布于昆蟲的觸角中，如苜蓿盲蝽（）特異性表達(dá)于足中[21]；埃及伊蚊（）在觸角、喙、精囊和氣門中均有表達(dá)[22]；棉鈴蟲（）在雌蟲翅膀中表達(dá)量較高[23]；松墨天牛（）和高表達(dá)于雄蟲頭部，觸角表達(dá)量最低[24]；中華蜜蜂低豐度表達(dá)于頭、胸、腹、足和翅膀中[25]，在足中表達(dá)量最高[26]，在采集蜂的觸角、足和翅膀中均有表達(dá)[27]。【本研究切入點(diǎn)】目前中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白的研究主要集中在典型OBP上，但有關(guān)Minus-C OBPs表達(dá)及功能尚無報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在中華蜜蜂觸角轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，克隆得到中華蜜蜂的一個Minus-C OBP基因（），并對其蛋白結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測，利用real-time PCR技術(shù)進(jìn)一步對其時空表達(dá)情況進(jìn)行分析，以期為該蛋白的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年3—9月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1.1 供試?yán)ハx

試驗(yàn)用中華蜜蜂樣本于2015年5—6月份采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院中華蜜蜂試驗(yàn)場。選取群勢較強(qiáng)、健康無病的正常蜂群，從中抽出一張新蜂將要出房的成熟封蓋子脾于人工培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)（34℃），待其羽化出房后用無味無毒的油漆在背部進(jìn)行標(biāo)記（約2 500只），再放回原來的蜂巢，分別在成蜂1、5、10、15、20、25、30日齡時進(jìn)行采樣。每個日齡采300只，隨機(jī)分為3組，按觸角、頭（去除觸角）、胸、腹、足和翅6個組織進(jìn)行分離。每100只工蜂各組織的混合樣作為一個生物學(xué)重復(fù)，迅速投入盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，倒入裝有1 mL RNAiso Plus的1.5 mL離心管中，-80℃保存。

1.2 主要試劑和儀器

Total RNA提取試劑盒RNAiso Plus、第一鏈cDNA合成試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）、克隆載體pMDTM19-T Vector Cloning Kit、熒光定量試劑盒SYBR?TMII （Tli RNaseH Plus）、DNA Marker DL 1000、氨芐青霉素、IPTG、X-Gal、50×TAE Buffer等試劑均購自大連寶生物公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans5、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒E.Z.D.ATMGel Extraction Kit（OMEGA，USA）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR反應(yīng)試劑2×Es Taq MasterMix（含染料）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，異丙醇、氯仿、無水乙醇等分析純購自北京化工廠。

ABI梯度PCR儀由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)，實(shí)時熒光定量PCR儀Mx3000P由美國Stratagene公司生產(chǎn)，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)由美國BIO-RAD公司生產(chǎn)，5430R小型臺式高速冷凍離心機(jī)由德國艾本德Eppendorf股份公司生產(chǎn)，ND-1000核酸蛋白濃度測定儀由美國NanoDrop科技有限責(zé)任公司制造。

1.3 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

各組織樣本總RNA的提取按照RNAiso Plus試劑盒說明書進(jìn)行。在測定濃度和純度之后，再根據(jù)PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行下一步試驗(yàn)。其中，不同日齡的不同組織cDNA模板用于熒光定量PCR反應(yīng)；整只蜜蜂全組織cDNA模板用于目的基因的克隆。

1.4 引物設(shè)計(jì)

以筆者課題組前期所獲得的中華蜜蜂觸角轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，通過BLASTN比對得到目的基因片段。使用Primer Premier 5.0軟件在相似性較高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的cDNA序列。根據(jù)克隆得到的序列預(yù)測該基因的開放閱讀框（ORF），并在此區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物用于熒光定量PCR。本試驗(yàn)選擇西方蜜蜂的（actin releated protein 1）序列（GenBank登錄號：NM_001185145.1）作為內(nèi)參基因，引物信息詳見表1。所用引物由北京華大基因科技有限公司合成。

1.5的cDNA克隆

以中華蜜蜂全組織cDNA為模板，使用2×Es Taq MasterMix試劑盒在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物（10 μmol?L-1）各1 μL，RNase-Free Water 6 μL，總體系為20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃終延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段進(jìn)行切膠，并根據(jù)E.Z.D.ATMGel Extraction Kit試劑盒使用說明進(jìn)行DNA回收，將回收產(chǎn)物連接到pMDTM19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化至Trans5感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選鑒定，翌日挑取單一白色菌落至含Amp（1﹕1 000）的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。菌液經(jīng)PCR鑒定，將陽性克隆產(chǎn)物送北京華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

表1 本研究所用引物

1.6序列的生物信息學(xué)分析

將測序所得序列在NCBI中用Blastn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具進(jìn)行核酸序列的同源性分析，利用在線軟件ORF Finder（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找序列的開放閱讀框，使用Lasergene軟件中的EditSeq工具預(yù)測其編碼的氨基酸序列。運(yùn)用在線工具NCBI Conserved Domains（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析保守結(jié)構(gòu)域；ProtParam（http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）預(yù)測蛋白的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；ProtScale（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）進(jìn)行疏水性分析；SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽序列；TMHMM-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析跨膜結(jié)構(gòu)；SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析功能結(jié)構(gòu)域；PSORT II（http://psort.hgc.jp/form2.html）和LocTree 3（https://rostlab.org/services/loctree3/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位[28]；PredictProtein（https://www.predictprotein.org/）預(yù)測氨基酸序列中二硫鍵的位置。將去除信號肽的氨基酸序列導(dǎo)入在線軟件PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org/）分別進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸的多序列比對，采用MEGA5.2軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootrap為1 000次。

1.7 熒光定量PCR反應(yīng)

以各日齡的成蜂cDNA（反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行4倍稀釋）為模板，使用SYBR?TMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR?TMII（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（2×）0.4 μL，上、下游引物（10 μmol?L-1）各0.8 μL，cDNA模板2 μL，滅菌超純水6 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；接著進(jìn)行45個循環(huán)：95℃ 30 s，60℃ 34 s。測定熔解曲線的反應(yīng)條件：以0.5℃的升溫速度從60℃升至95℃。每個樣品進(jìn)行3次平行重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

熒光定量結(jié)果應(yīng)用MXPro-MX3000P軟件（Stratagene，美國）進(jìn)行分析處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及熒光曲線的Ct值，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用SPSS17.0軟件中的ANOVA法進(jìn)行單因素方差分析，并選用Duncan’s法進(jìn)行顯著性差異分析。所得結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，并利用GraphPad Prism 5.2軟件進(jìn)行圖形分析。

2 結(jié)果

2.1

以中華蜜蜂全組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期長度一致的目的片段，克隆獲得菌液PCR結(jié)果顯示為陽性，送至測序公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明該片段大小為497 bp。將該序列在NCBI中進(jìn)行BLASTN比對，與西方蜜蜂（GenBank登錄號：NM_001040223.1）核苷酸序列相似性為92%，因此命名為。該基因已在GenBank中注冊，登錄號為KT246483。

利用ORF Finder對所獲得的序列分析表明，cDNA序列包括37 bp的5′非編碼區(qū)（5′UTR）、408 bp的完整開放閱讀框（ORF）和52 bp的3′非編碼區(qū)（3′UTR），共編碼135個氨基酸（圖1）。AcerOBP14蛋白分子式為C673H1101N167O204S9，預(yù)測分子量為15.08 kD，理論等電點(diǎn)為5.44。在組成AcerOBP14蛋白的18種氨基酸中，賴氨酸（Lys）所占的比例最高，達(dá)到11.9%；帶正電荷氨基酸總數(shù)（Arg+Lys）為16，帶負(fù)電荷氨基酸總數(shù)（Asp+Glu）為18，表明該蛋白不帶電荷；總平均疏水系數(shù)（GRAVY）為0.105，不穩(wěn)定系數(shù)為25.36，脂溶系數(shù)為107.48，說明該蛋白比較穩(wěn)定。AcerOBP14的氨基酸序列中含有4個保守的半胱氨酸位點(diǎn)，缺失第2個和第5個保守的半胱氨酸，屬于Minus-C OBP亞家族。

小寫字母為非編碼區(qū)，大寫字母為開放閱讀框；起始密碼子和終止密碼子用粗體標(biāo)識，信號肽序列用下劃線標(biāo)注，保守半胱氨酸位點(diǎn)用紅色方框標(biāo)注Non-coding region was showed by lowercase letters, ORF was showed by uppercase letters, the start and stop codons were indicated by bold, signal peptide was underlined, conversed cysteine residues were boxed in red

2.2 AcerOBP14蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

在線NCBI結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，編碼產(chǎn)物的第18—127位氨基酸之間存在一個昆蟲氣味結(jié)合蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域PBP-GOBP superfamily（圖2）。AcerOBP14蛋白的信號肽位于1—16位氨基酸，剪切位點(diǎn)位于16和17位氨基酸之間，無跨膜結(jié)構(gòu)。疏水性分析顯示，AcerOBP14的氨基酸序列中，第27位氨基酸Score值最低為-1.822，第8位氨基酸最高為3.244，平均疏水性為0.105；存在多個比較明顯的疏水區(qū)域（Score為正值的區(qū)域），它們可能是脂溶性氣味分子的結(jié)合位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，AcerOBP14蛋白可能存在于細(xì)胞外（66.7%）、液泡（11.1%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（11.1%）和線粒體（11.1%）中，主要集中在分泌途徑上，說明該蛋白屬于分泌型蛋白。該蛋白的第29—127位氨基酸之間存在一個PhBP功能結(jié)構(gòu)域，可能與其特異性結(jié)合氣味分子、調(diào)控嗅覺機(jī)制有關(guān)。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，-螺旋（helix）、折疊股（strand）和卷曲環(huán)（loop）的比例分別為54.81%、41.48%和3.7%。以西方蜜蜂OBP14（PDB登錄號：3S0A）為模板對其進(jìn)行3-D結(jié)構(gòu)的預(yù)測（圖3），結(jié)構(gòu)相似度為84.03%。從圖3可以看出，該蛋白包含7個螺旋，其中1（19—37）、2（41—49）、3（57—70）、4（82—89）、5（94—105）和6（112—126）為典型OBP的核心螺旋區(qū)域。7在C端的130—133位氨基酸之間，暴露于蛋白表面[17]。兩對二硫鍵的半胱氨酸殘基對Cys33-Cys65連接著1和2螺旋，Cys104-Cys122連接著5和6，這些結(jié)構(gòu)可能形成一個與氣味物質(zhì)結(jié)合的空腔。

圖2 AcerOBP14的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域預(yù)測

圖3 中華蜜蜂AcerOBP14蛋白的3-D結(jié)構(gòu)預(yù)測模型

2.3 AcerOBP14的序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將克隆所得核酸序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BlastX分析，找到與目的基因有同源性的膜翅目其他昆蟲的氨基酸序列。序列比對結(jié)果顯示，中華蜜蜂AcerOBP14與其他昆蟲OBPs的氨基酸序列一致性差別較大（圖4）。中華蜜蜂AcerOBP14與西方蜜蜂AmelOBP14的氨基酸序列一致性最高，達(dá)到86%，其次是大蜜蜂AdorGOBP56a-like，一致性為55%。此外，AcerOBP14與同屬M(fèi)inus-C OBP亞家族的AcerOBP21氨基酸序列一致性只有46%，同源性較低，這可能與不同氣味結(jié)合蛋白在中華蜜蜂嗅覺識別及產(chǎn)生行為反應(yīng)的過程中發(fā)揮的功能不同有關(guān)。使用MEGA5.2軟件鄰位相連法進(jìn)行1 000次重復(fù)計(jì)算后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。由圖5可以看出，所有選用的膜翅目昆蟲OBPs形成兩個大的分支：同為蜜蜂科蜜蜂屬的中華蜜蜂AcerOBP14、西方蜜蜂AmelOBP14、大蜜蜂AdorGOBP56a-like、中華蜜蜂AcerOBP21和小蜜蜂AfloGOBP56d-like聚為一個分支，其中AcerOBP14與AmelOBP14親緣關(guān)系最近；切葉蜂屬的苜蓿切葉蜂MrotGOBP56a-like、側(cè)溝繭蜂屬的毀側(cè)溝繭蜂MdemGOBP83a-like、壁蜂屬的角額壁蜂OcorOBP3和熊蜂屬的BterGOBP56d-like和BimpGOBP56d-like聚為另一大分支。

信號肽序列用黃色方框標(biāo)注，保守半胱氨酸位點(diǎn)用紅色方框標(biāo)注 The amino acids in yellow frame were the signal peptide. Conversed cysteine residues were boxed in red。OBP蛋白來源及GenBank登錄號 Origin of OBP proteins and their GenBank accession numbers: AmelOBP14, Apis mellifera (NP_001035313.1); AdorGOBP56a-like, Apis dorsata (XP_006609098.1); AcerOBP21, Apis cerana cerana (AKQ98509.1); AfloGOBP56d-like, Apis florae (XP_003695876.1); MrotGOBP56a-like, Megachile rotundata (XP_003708550.1); OcorOBP3, Osmia cornuta (AGI05202.1); BimpGOBP56d-like, Bombus impatiens (XP_003494618.1); BterGOBP56d-like, Bombus terrestris (XP_003402792.1); MdemGOBP83a-like, Microplitis demolitor (XP_008548247.1)

圖5 基于氨基酸序列構(gòu)建的膜翅目昆蟲OBPs的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4mRNA時空表達(dá)分析

以10日齡頭部表達(dá)量為基準(zhǔn)，通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析在1、5、10、15、20、25和30日齡中華蜜蜂不同組織中mRNA的表達(dá)差異（圖6）。由圖6可以看出，在中華蜜蜂不同發(fā)育期的觸角、頭、胸、腹、足和翅中均有表達(dá)，但其表達(dá)程度有差異。1日齡新生蜂胸部表達(dá)量最高，觸角次之，均極顯著高于其他組織（＜0.01），足中表達(dá)量極顯著高于腹、頭和翅（＜0.01）。5日齡內(nèi)勤蜂觸角中的表達(dá)量極顯著高于其他組織（＜0.01），頭、胸、足和翅中表達(dá)量極顯著高于腹部（＜0.01）。25日齡采集蜂觸角中的表達(dá)量極顯著高于其他組織（＜0.01），頭部表達(dá)量極顯著高于除觸角外的其他組織（＜0.01），胸、腹、足和翅之間差異不顯著（＞0.05），胸部表達(dá)量最低。10、15、20和30日齡成蜂觸角中的表達(dá)量極顯著高于其他組織（＜0.01），其他組織之間差異不顯著（＞0.05）；其中，15日齡胸部表達(dá)量最低，其他3個日齡腹部表達(dá)量最低。從各組織在不同發(fā)育階段的表達(dá)量來看，觸角的表達(dá)量在1日齡最低，極顯著地低于其他日齡（＜0.01）；5、10日齡逐漸增加，15日齡突然下降，20日齡達(dá)到最高，極顯著高于其他日齡（＜0.01），約為1日齡的7.5倍；之后又呈逐漸下降趨勢。頭、胸、腹、足和翅表達(dá)量總體上隨日齡增加而呈下降趨勢，5日齡之后大幅下降，之后趨于平穩(wěn)且呈低豐度表達(dá)。

圖中數(shù)據(jù)是以10日齡工蜂的頭部表達(dá)量作為基準(zhǔn)Data in graph were based on the expression in the head of 10-day-old workers。An：觸角Antenna；H：頭Head；T：胸Thorax；Ab：腹Abdomen；L：足Legs；W：翅Wings；1—30 d：成年工蜂的日齡Days of adult worker bees。柱上不同大寫字母表示成蜂同一日齡不同組織間的表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01）Different uppercase letters above bars indicated significant differences in the expression levels in different tissues (P＜0.01)

3 討論

氣味結(jié)合蛋白在昆蟲識別和結(jié)合外界氣味分子的生化反應(yīng)過程中具有重要意義[29-31]。本研究通過RT-PCR技術(shù)成功克隆了中華蜜蜂cDNA序列，ORF長為408 bp，編碼135個氨基酸，預(yù)測分子量為15.08 kD，序列中含有保守的半胱氨酸位點(diǎn)，具有氣味結(jié)合蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征，并且N-末端包含一個由16個氨基酸組成的信號肽，與報道的昆蟲氣味結(jié)合蛋白特征基本一致。AcerOBP14只編碼4個保守的Cys位點(diǎn)，形成兩個二硫鍵，相比典型OBP亞家族缺少Cys2和Cys5兩個保守半胱氨酸位點(diǎn)，屬于Minus-C OBP亞家族。OBPs可以傳導(dǎo)性信息素信號，稱為性信息素結(jié)合蛋白（PBPs）；也可以傳導(dǎo)一般氣味信號，稱為普通氣味結(jié)合蛋白（GOBPs）。氨基酸同源序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，AcerOBP14與西方蜜蜂AmelOBP14和大蜜蜂AdorGOBP56a-like同源性較高，親緣關(guān)系較近，因此推測AcerOBP14可能是與普通氣味分子結(jié)合的蛋白[27]。

分泌蛋白是指在細(xì)胞質(zhì)的核糖體上合成、分泌到細(xì)胞外起作用的一類蛋白質(zhì)。幾乎所有的分泌蛋白都具有信號肽[32]，為N端的15—35個氨基酸的疏水性序列，在蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-質(zhì)膜分泌過程中具有重要作用。信號肽是檢測蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白的一個重要指標(biāo)[33]。AcerOBP14的N-末端包含一個由16個氨基酸組成的信號肽，剪切位點(diǎn)位于16和17位氨基酸之間，這說明AcerOBP14具有分泌蛋白的特征。亞細(xì)胞定位軟件LocTree 3預(yù)測結(jié)果顯示，AcerOBP14蛋白主要集中在分泌途徑上，與上述推斷一致。

一般認(rèn)為在觸角中特異性表達(dá)的OBPs與昆蟲信息素的識別相關(guān)，而同時在其他部位也有表達(dá)的OBPs與識別普通氣味物質(zhì)有關(guān)[34]。本研究熒光定量結(jié)果表明，在成年工蜂不同日齡的各個組織中均有表達(dá)，這說明AcerOBP14可能屬于普通氣味結(jié)合蛋白，能夠有效感受不同的氣味物質(zhì)，這與本研究系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的結(jié)果相一致。在各組織中的表達(dá)量隨著日齡的變化而變化，暗示不同日齡的中華蜜蜂對巢內(nèi)化學(xué)物質(zhì)及外界氣味物質(zhì)的感受和識別是有差異的，在嗅覺系統(tǒng)和社會勞動分工過程中起著重要調(diào)節(jié)作用。Forêt等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在意大利蜜蜂幼蟲期和成蜂中均有表達(dá)，且出房后各日齡的表達(dá)量無明顯差異，這與表達(dá)情況明顯不同，筆者認(rèn)為中華蜜蜂嗅覺靈敏度、抗逆抗螨能力等方面優(yōu)于西方蜜蜂是引起這種差異的可能原因之一，但也不排除采樣時期、巢內(nèi)外環(huán)境等因素的影響[35]。

觸角是昆蟲嗅覺感器的主要部位[36]。在各組織中均有表達(dá)，但在觸角中表達(dá)量相對較高，推測可能主要行使嗅覺相關(guān)功能，但也涉及到更廣泛的生理功能。20日齡觸角中的表達(dá)量極顯著高于其他日齡，可能與中華蜜蜂的外出采集行為有關(guān)，這時高表達(dá)的能更有效地識別和結(jié)合外界的氣味物質(zhì)，有助于由內(nèi)勤蜂轉(zhuǎn)變?yōu)橥馇诜浜髮ふ颐鄯墼椿蚨惚芴鞌场Ｃ鄯涞男袨槭鞘艿侥撤N刺激的結(jié)果，一旦某種行為啟動，就會相對固定地重復(fù)進(jìn)行[37]。隨著日齡的增加和機(jī)體的內(nèi)在變化，在觸角中的表達(dá)量雖然逐漸減少，但仍能以采集花粉、花蜜和水等活動為主。為了進(jìn)一步驗(yàn)證在中華蜜蜂嗅覺識別中的作用，尚需獲得大量的AcerOBP14蛋白并對其生物學(xué)功能做深入的研究。

4 結(jié)論

成功克隆了中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白基因cDNA序列。序列分析表明，AcerOBP14具有PBP-GOBP家族的典型結(jié)構(gòu)，屬于Minus-C OBP亞家族，與西方蜜蜂AmelOBP14的親緣關(guān)系最近。時空表達(dá)結(jié)果顯示，在不同日齡工蜂的觸角、頭、胸、腹、足和翅中均有表達(dá)，暗示該蛋白屬普通氣味結(jié)合蛋白GOBP，其在中華蜜蜂中不僅僅局限于嗅覺識別功能，可能還涉及更廣泛的生理機(jī)制。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Cloning and Expression Analysis of Odorant Binding Protein Genefrom

DU Ya-li1, ZHANG Zhong-yin2, PAN Jian-fang1, WANG Shu-jie1, YANG Shuang1,3, ZHAO Hui-ting4, JIANG Yu-suo1

(1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2College of Resources and Environment, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, Henan;3Sericultural and Apicultural Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Mengzi 661101, Yunnan;4College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi)

【Objective】The objective of this study is to clone the cDNA sequence offrom, predict the protein structure, explore its expression profiles in different tissues and at different developmental stages of.., and to provide a fundamental evidence for the future study of the physiological function of this gene.【Method】The full-length cDNA sequence ofwas cloned from the entire tissues ofby RT-PCR and submitted to the GenBank database. Physiochemical properties and structure characteristics of the deduced amino acid sequence were analyzed by multiple bioinformatics methods. Phylogenetic tree between AcerOBP14 and its homologous OBPs from Hymenoptera insects was constructed using neighbor-joining of MEGA5.2.The expression levels ofmRNA in different tissues (antenna, head, thorax, abdomen, legs and wings) at 1, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 days were detected by real-time PCR.【Result】The full-length cDNA sequence ofwas obtained (GenBank accession number is KT24648). The open reading frame (ORF) ofis 408 bp, encoding a protein of 135 aa with an estimated molecular weight of 15.08 kD and pI of 5.44. The encoding protein has a signal peptide and no transmembrance structure, possesses a PBP-GOBP superfamily domain between 18-127 residues, exists multiple obviously hydrophobic regions binding liposoluble odorant and contains four conserved cysteins, suggesting that it belongs to the Minus-C OBP subfamily. Subcellular localization results showed that AcerOBP14 was located on the secretory pathway about endoplasmic reticulum, golgi and plasmalemma which belongs to the secretory protein. AcerOBP14 possesses 7-helixs, among which the1-6 belong to the core helixs of classical OBPs and7 is exposed to the surface of protein at the C-terminus. The results of amino acid sequence alignment showed that AcerOBP14 was homologous to AmelOBP14 with 86% amino acid sequence identity, and then had 55% sequence identity with AdorGOBP56a-like. Phylogenetic analysis revealed that AcerOBP14, AmelOBP14, AdorGOBP56a-like, AcerOBP21 and AfloGOBP56d-like belonging to thewere clustered into one group, MrotGOBP56a-like (), MdemGOBP83a-like (), OcorOBP3 (), BterGOBP56d-like () and BimpGOBP56d-like () were clustered into the other group. Besides, the results of real-time PCR showed that thetranscripts were differentially expressed in the antenna, head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult workers. The thorax of 1-day-old workers had the highest expression level of, the antenna had the second highest expression level, and both of them were significantly higher than the head, abdomen, legs and wings (＜0.01). Moreover, the expression profiles in worker bees at other days were significantly higher in antenna than that in other tissues (＜0.01), of which the antenna of 20-day-old workers had the highest expression level. According to the expression profiles ofat different developmental stages, the antenna of workers had the lowest expression level at 1-day-old which was significantly lower than other days (＜0.01), increased gradually at 5-day-old and 10-day-old, then decreased suddenly at 15-day-old. The expression level at 20-day-old was significantly higher than other days (＜0.01), afterwards, the expression level gradually reduced. Generally, the expression profiles of the head, thorax, abdomen, legs and wings appeared a downward trend with the days of age increasing, and maintained a lower level after decreasing remarkably at 5-day-old.【Conclusion】AcerOBP14 belongs to the Minus-C OBP subfamily with a PBP-GOBP superfamily domain. The results of expression profiling suggested that AcerOBP14 belongs to general odorant binding protein (GOBP) and is involved in not only the olfactory recognition, but also other physiological functions.

;; gene cloning; bioinformatics analysis; temporal-spacial expression

2016-01-30；接受日期：2016-03-11

國家自然科學(xué)基金（31272513，31502021）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（cars-45-syz10）

杜亞麗，E-mail：duyali2000@yeah.net。通信作者姜玉鎖，Tel：0354-6285990；E-mail：jiangys-001@163.com