高效液相色譜法鑒定甘草有效成分的作用探討

江蘇省啟東市綜合檢驗(yàn)檢測中心（226200）高建華

甘草黃酮屬于一種具有較強(qiáng)活性的生物成分，目前其相應(yīng)的提取分離技術(shù)正在高速的發(fā)展。本文通過建立并且檢測甘草黃酮類有效成分的方法，為未來尋找更有效提取分離甘草黃酮化合物單一成分的方法提供一定的參考，為更好地利用甘草資源提供充分的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)試劑

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器 HITACHI高效液相色譜儀（日本日立公司）；YCQ-300超聲波清洗器（上海凱波超聲儀器公司）；超純水儀器（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；AG135電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試劑 對照品：甘草素與異甘草素；色譜純：甲醇（天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心）；超純水；分析純：甲醇、乙腈、乙醇（95%）、冰醋酸等。

1.3 樣品 甘草素樣品（陜西中藥研究所）

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果分析

2.1 色譜條件 ①流動相：乙腈-冰醋酸（1∶4），進(jìn)樣量為20μl，流速為每分鐘1.0ml。通過實(shí)驗(yàn)比較以下幾種流動相：a甲醇一水(3∶7)；b乙睛一水(3∶7)；c乙睛一1.0%醋酸(l∶4)；d乙睛一0.5%醋酸(1∶4)等，結(jié)果表明，采用乙睛-0.5%冰醋酸(l∶4)作為流動相具有良好的分離效果，可予以使用。②色譜柱：YWGC18（250mm×4.6mm×10um） 采用YWGC18（250mm×4.6mm×10um）色譜柱進(jìn)行對照，柱溫度保持為室溫水平，波長檢測為276nm，根據(jù)色譜條件進(jìn)行測定，樣品甘草素成分分離度良好。

2.2 制備對照品溶液 采用高精度電子天平稱取甘草素對照品，質(zhì)量為10mg，放在50ml容量瓶內(nèi)，首先加入甲醇進(jìn)行稀釋，時(shí)間為5分鐘，然后繼續(xù)加入流動相定容100毫升，充分搖勻。

2.3 制備供試品溶液 把供試品研細(xì)，選取粉末狀的供試品進(jìn)行精密的稱定，大概0.2克，放在帶塞的錐形瓶中，加入10毫升的乙醇（70%），搖勻，進(jìn)行密封與稱重，通過超聲進(jìn)行提取，時(shí)間為30分鐘，控制超聲溫度在20度到32度之間。等待冷卻后再次稱重，如果失重則可以通過加入乙腈（20%）補(bǔ)足，使用微孔濾膜進(jìn)行過濾即可取得過濾液0.5ml。半小提取樣品完畢后應(yīng)當(dāng)在半小時(shí)到10小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行測定。

2.4 檢測波長的選擇 吸取對照品儲備液（0.6ml），放進(jìn)10ml量瓶，使用流動相進(jìn)行定容，波長范圍在200～400nm，掃描測定結(jié)果顯示：甘草素在276nm處有最大吸收，所以選定276nm為測定波長。

附表 對甘草素含量檢測的回收率實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性分析 精密量取對照液，分別為0.5ml、1.0mL、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分置10mL量瓶中，加入20%乙腈流動相進(jìn)行稀釋直至量杯的刻度，再分別按照色譜條件進(jìn)樣20ul，記錄峰面積值A(chǔ)，以峰面積A對濃度C進(jìn)行線性回歸。

甘草素對照品的線性關(guān)系以及范圍如下：甘草素的回歸方程：y=0.0050x－0.8000，R2=0.9991。標(biāo)準(zhǔn)曲線在檢測范圍內(nèi)呈良好線性。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取出標(biāo)準(zhǔn)溶液20μg/ml，按照色譜的條件連續(xù)測試5次，記錄每次的峰面積，計(jì)算其RSD為0.53%。通過測定顯示，儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取適量供試品溶液，按照色譜的條件進(jìn)行測定，測定的時(shí)間分別是0h、8h、12h、24h、36h，計(jì)算峰面積，RSD為1.5%。通過測定顯示，供試品溶液可以在36小時(shí)以內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取甘草樣品，量為0.2g，一共5份，制備供試品溶液，進(jìn)樣20μl，使用面積外標(biāo)法對甘草素與異甘草素含量進(jìn)行測定，平均含量為2.5%，n=5，RSD=1.35%。

2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 使用高精度電子天平稱取樣品0.2g，一共有5份，按照對照品溶液配制的方法進(jìn)行配制，定容為50ml，搖勻，過濾。精密量取過濾液，量為5毫升，放在容量瓶（25ml），加入對照品溶液，定容，搖勻，進(jìn)樣，對峰面積進(jìn)行記錄。代入回歸方程計(jì)算濃度C值，計(jì)算平均回收率。回收率在99%～108%，具有良好的準(zhǔn)確性。如附表所示。

3 討論

本研究表明，建立用高效液相色譜法測定甘草中甘草昔含量的方法，基于相同的色譜條件對甘草素樣品的甘草素含量進(jìn)行測定，具有良好的分離效果，當(dāng)其濃度為4～60μg/ml的時(shí)候，具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為101%，RSD為1.35%。

綜上所述，高效液相法在檢測甘草素與異甘草素含量中操作簡單且應(yīng)用效果良好，可以作為甘草素與異甘草素的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。