高效液相色譜法鑒定甘草有效成分的作用探討

江蘇省啟東市綜合檢驗檢測中心（226200）高建華

甘草黃酮屬于一種具有較強活性的生物成分，目前其相應的提取分離技術正在高速的發展。本文通過建立并且檢測甘草黃酮類有效成分的方法，為未來尋找更有效提取分離甘草黃酮化合物單一成分的方法提供一定的參考，為更好地利用甘草資源提供充分的依據。

1 實驗儀器和實驗試劑

1.1 主要實驗儀器 HITACHI高效液相色譜儀（日本日立公司）；YCQ-300超聲波清洗器（上海凱波超聲儀器公司）；超純水儀器（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；AG135電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試劑 對照品：甘草素與異甘草素；色譜純：甲醇（天津市永大化學試劑開發中心）；超純水；分析純：甲醇、乙腈、乙醇（95%）、冰醋酸等。

1.3 樣品 甘草素樣品（陜西中藥研究所）

2 試驗方法與結果分析

2.1 色譜條件 ①流動相：乙腈-冰醋酸（1∶4），進樣量為20μl，流速為每分鐘1.0ml。通過實驗比較以下幾種流動相：a甲醇一水(3∶7)；b乙睛一水(3∶7)；c乙睛一1.0%醋酸(l∶4)；d乙睛一0.5%醋酸(1∶4)等，結果表明，采用乙睛-0.5%冰醋酸(l∶4)作為流動相具有良好的分離效果，可予以使用。②色譜柱：YWGC18（250mm×4.6mm×10um） 采用YWGC18（250mm×4.6mm×10um）色譜柱進行對照，柱溫度保持為室溫水平，波長檢測為276nm，根據色譜條件進行測定，樣品甘草素成分分離度良好。

2.2 制備對照品溶液 采用高精度電子天平稱取甘草素對照品，質量為10mg，放在50ml容量瓶內，首先加入甲醇進行稀釋，時間為5分鐘，然后繼續加入流動相定容100毫升，充分搖勻。

2.3 制備供試品溶液 把供試品研細，選取粉末狀的供試品進行精密的稱定，大概0.2克，放在帶塞的錐形瓶中，加入10毫升的乙醇（70%），搖勻，進行密封與稱重，通過超聲進行提取，時間為30分鐘，控制超聲溫度在20度到32度之間。等待冷卻后再次稱重，如果失重則可以通過加入乙腈（20%）補足，使用微孔濾膜進行過濾即可取得過濾液0.5ml。半小提取樣品完畢后應當在半小時到10小時以內進行測定。

2.4 檢測波長的選擇 吸取對照品儲備液（0.6ml），放進10ml量瓶，使用流動相進行定容，波長范圍在200～400nm，掃描測定結果顯示：甘草素在276nm處有最大吸收，所以選定276nm為測定波長。

附表 對甘草素含量檢測的回收率實驗檢測結果

2.5 方法學考察

2.5.1 線性分析 精密量取對照液，分別為0.5ml、1.0mL、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分置10mL量瓶中，加入20%乙腈流動相進行稀釋直至量杯的刻度，再分別按照色譜條件進樣20ul，記錄峰面積值A，以峰面積A對濃度C進行線性回歸。

甘草素對照品的線性關系以及范圍如下：甘草素的回歸方程：y=0.0050x－0.8000，R2=0.9991。標準曲線在檢測范圍內呈良好線性。

2.5.2 精密度試驗 取出標準溶液20μg/ml，按照色譜的條件連續測試5次，記錄每次的峰面積，計算其RSD為0.53%。通過測定顯示，儀器的精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 取適量供試品溶液，按照色譜的條件進行測定，測定的時間分別是0h、8h、12h、24h、36h，計算峰面積，RSD為1.5%。通過測定顯示，供試品溶液可以在36小時以內保持穩定。

2.5.4 重復性試驗 精密稱取甘草樣品，量為0.2g，一共5份，制備供試品溶液，進樣20μl，使用面積外標法對甘草素與異甘草素含量進行測定，平均含量為2.5%，n=5，RSD=1.35%。

2.5.5 加樣回收率實驗 使用高精度電子天平稱取樣品0.2g，一共有5份，按照對照品溶液配制的方法進行配制，定容為50ml，搖勻，過濾。精密量取過濾液，量為5毫升，放在容量瓶（25ml），加入對照品溶液，定容，搖勻，進樣，對峰面積進行記錄。代入回歸方程計算濃度C值，計算平均回收率。回收率在99%～108%，具有良好的準確性。如附表所示。

3 討論

本研究表明，建立用高效液相色譜法測定甘草中甘草昔含量的方法，基于相同的色譜條件對甘草素樣品的甘草素含量進行測定，具有良好的分離效果，當其濃度為4～60μg/ml的時候，具有良好的線性關系，平均回收率為101%，RSD為1.35%。

綜上所述，高效液相法在檢測甘草素與異甘草素含量中操作簡單且應用效果良好，可以作為甘草素與異甘草素的質控標準。