熄風靜寧顆粒對Tourette綜合征模型大鼠行為活動及腦紋狀體多巴胺遞質的影響*

李　燕王新征康珈寧孫　婷王俊宏△

（1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京100700；2.北京市朝陽區常營社區衛生服務中心，北京100024；3.河南省南陽市中醫院，河南　南陽473000）

熄風靜寧顆粒對Tourette綜合征模型大鼠行為活動及腦紋狀體多巴胺遞質的影響*

李燕1王新征2康珈寧3孫婷1王俊宏1△

（1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京100700；2.北京市朝陽區常營社區衛生服務中心，北京100024；3.河南省南陽市中醫院，河南南陽473000）

目的觀察熄風靜寧顆粒對Tourette綜合征（TS）模型大鼠行為活動，及腦紋狀體多巴胺（DA）、血清高香草酸（HVA）含量的影響。方法Wistar雄性大鼠42只隨機分為正常組、模型組、氟哌啶醇組、熄風靜寧顆粒低劑量組［1.2 g/（kg·d）］、熄風靜寧顆粒中劑量組［2.4 g/（kg·d）］、熄風靜寧顆粒高劑量組［4.8 g/（kg·d）］，每組7只，采用亞氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射建立TS大鼠模型，造模后，正常組和模型組給予蒸餾水灌胃，其余4組分別予相應藥物灌胃，連續給藥6周后，觀察比較各組大鼠的行為活動，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠紋狀體內DA、血清HVA含量。結果熄風靜寧顆粒中、高劑量組及氟哌啶醇組可以減輕TS模型大鼠抽動行為，與模型組比較均存在明顯差異。模型組大鼠腦紋狀DA含量明顯低于正常組（P＜0.05）。熄風靜寧顆粒中、高劑量組能增加大鼠腦紋狀體DA含量，與模型組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；熄風靜寧顆粒高劑量組大鼠血清HVA含量較低劑量組偏高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論熄風靜寧顆粒可以降低中樞神經興奮性，其治療作用可能是通過調節突觸后多巴胺受體敏感性或其他的藥物作用靶位實現。

熄風靜寧顆粒Tourette綜合征多巴胺高香草酸

【A bstract】Objective：To observe effects of Xifeng Jingning Decoction on the behavior，content of striatum dopamine（DA），and homovanillic acid（HVA）in ratsmodel of Tourette syndrome.M ethods：Male Wistar rats（n =42）were random ly divided into the blank group，themodel group，the haloperidol group，low-dose［1.2 g/（kg· d）］of Xifeng Jingning Decoction group，middle-dose［（2.4 g/（kg·d）］of Xifeng Jingning Decoction group，and high-dose［（4.8 g/（kg·d）］of Xifeng Jingning Decoction group（each n=7）.The Tourette syndromemodel was established in rats by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile（IDPN）.Aftermodeling，the blank group and themodel group were given normal saline solution intragastrically and other groups were given relevantmedicines for 6 weeks.The behaviorwas compared in all groups，and the content of striatum DA and HVA were detected by using enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）.Results：Middle-dose group and high-dose group of Xifeng Jingning Decoction，and haloperidol group lessened the stereotyped behavior in ratsmodel of Tourette syndrome with a significance difference，compared with themodel group.The content of DA decreased inmodel group compared with that in blank group（P＜0.05）.Compared with themodel group，there were differences in the contentof striatum DA inmiddle-dose and high-dose of Xifeng Jingning Decoction groups（P＜0.05）.The content of HVA increased in high-dose of Xifeng Jingning Decoction group，compared with that in low-dose of Xifeng Jingning Decoction，with a significance difference（P＜0.05）.Conclution：Xifeng Jingning Decoction can reduce the excitability of central nerve.The therapeutic effect of Xifeng Jingning Decoction may be implemented regulating the sensitivity of postsynaptic dopamine receptors or other drug targets.

【Key words】Xifeng Jingning Decoction；Tourette syndrome；Dopamine；Homovanillic acid

Tourette綜合征（TS）又稱多發性抽動癥，或抽動-穢語綜合征，是一種復雜的神經精神障礙性疾病，以多種不自主運動性抽動為主要表現，可伴有發聲抽動［1］。發作期急性癥狀嚴重者可影響患兒的學習及生活。TS病因及發病機制目前尚不十分清楚，而多巴胺系統功能異常被廣泛認為本病發病的主要病理學基礎［2］。熄風靜寧顆粒是我國著名中醫兒科專家劉弼臣教授的經驗方，臨床證實療效顯著，而且無明顯副作用［3-4］。但其作用靶點尚不明確，為進一步探求熄風靜寧顆粒治療該病的作用機制，筆者進行了如下研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠42只，清潔級，雄性，4周齡，體質量80～100 g。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2007-0001。分籠喂養，自由攝食飲水，溫度（22±2）℃，濕度50%～70%，通風。

1.2試藥和儀器氟哌定喘片（2 mg/片，寧波大紅鷹藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字H33020585，生產批號131003）；熄風靜寧顆粒（組成：辛夷花10 g，蒼耳子3 g，元參10 g，板藍根10 g，木瓜10 g，清半夏10 g，伸筋草20 g，鉤藤15 g，菊花15 g，白芍15 g，全蝎3 g，珍珠母30 g，酸棗仁30 g，炙甘草10 g，由北京康仁堂藥業有限公司制備）。亞氨基二丙腈（IDPN）購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒，多巴胺（DA，批號20150309），高香草酸（HVA，批號20150309），均購自上海藍基生物科技有限公司。全自動多功能酶標儀（MULTISKAN MK3，Thermo，USA）；電熱恒溫培養箱（DH4000A，天津泰斯特）；MINI shaker，MH-1（kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER）。

1.3分組與造模適應性喂養1周后，42只大鼠采用隨機數字法分為正常組、模型組、氟哌啶醇組、熄風靜寧顆粒低、中、高劑量組，每組7只。除正常組外，其余5組小鼠腹腔注射IDPN 150 mg/（kg·d），正常組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，每日1次，連續7 d。造模7 d后，觀察模型鼠的行為活動。包括：嗅、咬、舔（不包含理毛）、迅速移位、挖洞、急速跳躍等。由熟練掌握大鼠刻板行為并能準確評分但不熟悉組別的實驗人員每天觀察動物行為并評分。評分≥1分可判定造模成功。評分標準參考Napier等報道［5］。

1.4干預措施造模7 d后，正常組與模型組灌胃蒸餾水10mL/（kg·d）。熄風靜寧顆粒低、中、高劑量組灌胃熄風靜寧顆粒1.2、2.4、4.8 g/（kg·d）（熄風靜寧顆粒配成混懸液，低、中、高劑量各組質量濃度分別為1 mL含0.12 g、0.24 g、0.48 g中藥顆粒），氟哌啶醇組灌胃氟哌啶醇0.5 mg/（kg·d）（氟哌定喘片配成混懸液，質量濃度為1mL含0.05mg藥物），每日1次，各組均連續灌胃6周。

1.5標本采集與檢測1）動物行為評分：各組給藥后3周、6周均由實驗人員對動物行為進行評分，評分標準參考Napier等報道［5］。2）血清HVA、紋狀體DA的含量測定：血液標本采集在末次給藥24 h后，腹主動脈取血5mL，2000 r/min離心10min，分離血清，-20℃保存待檢測。紋狀體標本采集在末次給藥24 h后，斷頭取腦，冰上迅速剝離紋狀體，電子天平稱質量，于冰水中充分勻漿，低溫離心機4℃，3000 r/min離心10min，吸取上清液，-20℃保存待檢測。使用酶聯免疫吸附法（ELISA法）分別測定血清HVA、紋狀體DA的含量。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6統計學處理應用SPSS18.0軟件包，計量資料以（表示。組間比較采用單因素方差分析，方差齊以LSD檢驗；方差不齊以Games-Howell檢驗。P＜0.05為差異有統計意義。

2　結　果

2.1各組TS模型大鼠行為活動評分比較見表1。給藥3周后氟哌啶醇組大鼠刻板行為活動評分，與模型組比較存在明顯差異（P＜0.05）；給藥6周后大鼠行為活動評分，氟哌啶醇組、熄風靜寧顆粒中劑量組與模型組比較存在差異（P＜0.05），熄風靜寧顆粒高劑量組與模型組比較存在顯著差異（P＜0.01）。

表1　各組TS模型大鼠行為活動評分比較（分，

表1　各組TS模型大鼠行為活動評分比較（分，

與氟哌啶醇組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別n給藥6周后模型組7 3.00±0.58氟哌啶醇組7 2.29±0.76△熄風靜寧顆粒低劑量組7 2.43±0.54造模后　給藥3周后3.29±0.76 3.14±0.69 3.57±0.54 2.86±0.89 3.43±0.54 3.29±0.49熄風靜寧顆粒中劑量組7 2.29±0.49△3.86±0.38 3.43±0.54熄風靜寧顆粒高劑量組7 3.71±0.49 3.57±0.54*2.14±0.38△△

2.2各組TS模型大鼠腦紋狀體DA含量比較見表2。與正常組比較，模型組大鼠腦紋狀DA含量低于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；熄風靜寧顆粒中、高劑量組大鼠腦紋狀體DA含量與模型組比較，具有統計學差異（P＜0.05），氟哌啶醇組和熄風靜寧顆粒各組比較無明顯差異（P＞0.05）。

表2　各組TS模型大鼠腦紋狀體DA、血清HVA含量比較（ng/mL，

表2　各組TS模型大鼠腦紋狀體DA、血清HVA含量比較（ng/mL，

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與熄風靜寧顆粒低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別n 紋狀體DA血清HVA正常組7 19.93±7.04 28.01±8.20模型組7 12.01±3.01*26.49±8.64氟哌啶醇組7熄風靜寧顆粒低劑量組7 18.07±7.88 27.67±7.80 13.96±4.63 25.40±11.13熄風靜寧顆粒中劑量組7 19.95±7.35△30.15±12.94熄風靜寧顆粒高劑量組7 18.66±4.45△36.35±8.64▲

2.3各組TS模型大鼠血清HVA含量比較見表2。熄風靜寧顆粒高劑量組大鼠血清HVA與低劑量組比較存在明顯差異（P＜0.05）。

3　討　論

TS發現至今已有200多年的歷史，其病因及發病機制目前尚不十分清楚，但普遍認為其發病與遺傳因素、中樞神經遞質失衡、神經生化異常和精神因素等諸多方面有關［6］。但TS患者紋狀體內多巴胺神經過度支配或突觸后受體超敏感是目前公認的TS發病的神經生物化學因素［7］。HVA是中樞神經系統中DA的主要代謝產物，通常被作為判斷腦內DA含量的主要指標［8-9］。IDPN是一種中樞神經毒素，抽動的造模機制主要是通過破壞了錐體外系的DA系統，產生持久的降低DA濃度的效應，使動物在生長發育過程中出現DA受體超敏現象，導致刻板行為出現［10］。

本實驗應用IDPN成功地誘導出大鼠鼻嗅、仰頭、擺頭等類似TS癥狀行為。在對TS模型大鼠腦紋狀體DA含量的影響測定中，實驗結果顯示模型組大鼠腦紋狀體DA的含量較正常組下降，這與相關文獻報道基本一致［10-12］，推測原因可能是模型組小鼠腦組織存在多巴胺受體超敏感，通過負反饋機制抑制突觸前多巴胺釋放，提示了IDPN誘導的大鼠抽動行為可能與突觸間隙DA含量增加無關，而是由于多巴胺受體敏感性增強，導致多巴胺系統功能亢進造成。

本實驗結果顯示中藥顆粒可以顯著減輕TS模型的抽動癥狀，同時在對TS模型大鼠腦紋狀體DA含量和血清HVA含量影響的實驗中，結果顯示熄風靜寧顆粒中、高劑量能增加TS模型大鼠腦紋狀體DA含量，及TS模型大鼠中藥高劑量組較低劑量組血清HVA的含量有增多的趨勢。這些結果結合IDPN致使多巴胺受體敏感性增強引起抽動的造模機制，提示熄風靜寧顆粒藥物干預作用可能是通過調節突觸后多巴胺受體敏感性或其他的藥物作用靶位實現的。導致中藥顆粒能增加IDPN誘導的TS模型大鼠腦紋狀體DA含量，和組間比較血清HVA的含量有增多趨勢這一結果的原因，推測可能是由于突觸后超敏的DA受體被阻斷或藥物的作用靶位被調節，啟動反饋機制，使得觸前神經元釋放更多的DA，從而也增加相應的代謝產物。

TS根據其眨眼、擠眉、皺鼻、搖頭等臨床表現特點，現代醫家常將本病歸于“瘛癜”“慢驚風”“抽搐”肝風證“等范疇，治療多從肝、風入手［13-15］。然而我國著名中醫兒科專家劉弼臣教授獨辟蹊徑，從肺論治本病，成為TS中醫藥治療的一面旗幟。從肺論治TS，在改善TS主要的病理因素風、痰、氣方面具有重要的意義。熄風靜寧顆粒即是從肺調肝治療TS的代表方，臨床中在改善抽動癥狀、控制病情發展、副作用少等方面有著顯著的優勢。本實驗結果顯示，在給藥3周后，氟哌啶醇組TS模型大鼠行為活動的改善優于熄風靜寧顆粒高劑量組，提示氟哌啶醇在改善TS癥狀時間上較熄風靜寧顆粒起效時間早。但最終西藥氟哌啶醇及熄風靜寧顆粒均可改善IDPN所致TS模型大鼠的刻板運動及興奮性活動，提示了熄風靜寧顆粒具有氟哌啶醇類似的作用，能夠降低模型大鼠中樞興奮性，改善異常活躍的抽動行為，這一結果也佐證了熄風靜寧顆粒臨床療效的顯著性。氟哌啶醇常作為治療TS的第一選擇，但是長期應用后的副作用，甚至還出現抑郁癥狀，讓治療難以持久，而中藥熄風靜寧顆粒臨床副作用少，療效確切的優勢，更體現了它的臨床價值。

熄風靜寧顆粒方中辛夷花、蒼耳子宣肺通竅；玄參、板藍根清熱解毒利咽喉，祛邪護肺，防止外風引動內風；天麻、鉤藤、白芍、全蝎平肝熄風；伸筋草，歸肝脾腎諸經，有祛風、舒筋活血之功；木瓜，入肺、脾、肝諸經，理脾舒筋；甘草調和諸藥。綜觀全方，調肺巧配平肝，相得益彰［16］，療效顯著。

綜上所述，本研究顯示熄風靜寧顆粒可以改善中樞神經興奮性，抑制TS模型大鼠的異常行為活動，其作用機制可能是通過調節突觸后多巴胺受體敏感性或其他的藥物作用靶位實現的，但這一結論在本實驗中沒有獲得直接實驗依據的支持，需要以后更進一步的研究證實。

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Ef fects of Xifeng Jingning Decoction on Behavior and Dopam ine Nuerotransm ltter of Stratium in Rat M odel of Tourette Syndrome

LIYan，WANG Xinzheng，KANG Jianing，et al.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1660-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.005

2016-05-11）

·研究報告·

高等學校博士學科點專項科研基金項目（20120013120011）

（電子郵箱：jhwang3158@126.com）